Введение. Из предыдущей главы мы узнали, что детерминацию обусловливает распределение специфических цитоплазматических веществ между бластомерами в период дробления

Из предыдущей главы мы узнали, что детерминацию обусловливает распределение специфических цитоплазматических веществ между бластомерами в период дробления. Мы узнали также, что действием цитоплазматических детерминантов невозможно объяснить все детерминационные события в эмбриогенезе. В некоторых случаях для формирования определенного типа ткани необходимо взаимодействие между двумя бластомерами. Из этой главы мы узнаем о том, что способ детерминации посредством взаимодействий между частями зародыша имеет чрезвычайно важное значение, особенно для развития вторичноротых. таких, как морские ежи и позвоночные. Открытие этого типа детерминации уходит своими корнями в недостатки мозаичных теорий развития, сформулированных в Германии в конце прошлого столетия.

Август Вейсман: теория зародышевой плазмы

В 1883 г. Август Вейсман начал разрабатывать теорию, которая должна была интегрировать такие различные биологические явления, как наследственность, развитие, регенерация, половое размножение и эволюция путем естественного отбора. Вейсман был блестящим химиком и врачом, обратившим свое внимание на проблемы развития и метаморфоза. В 1863 г.. когда тяжелая болезнь глаз лишила его возможности пользоваться микроскопом, он стал задумываться над тем. каким образом из половых клеток возникают дифференцированные потомки. В поисках ответа на этот вопрос Вейсман освободился от прямых объяснений дарвиновского типа (т.е. от использования эмбриологии как аргумента для обоснования эволюционной родословной) и поставил эмбриологию на путь физиологических исследований, отдававших предпочтение экспериментальному вмешательству в развитие перед описательными наблюдениями.

Цитологические исследования семидесятых годов прошлого века дали Вейсману новую важную информацию, касающуюся полового размножения. Герман Фоль и Ричард Гертвиг независимо друг от друга наблюдали соединение яйца и спермия и их пронуклеусов. Такие исследователи, как ван Бенеден и Штрасбургер. показали, что каждое соматическое ядро содержит определенное число хромосом, зависящее от вида животного, а также что это число уменьшается вдвое в процессе созревания половых клеток и снова восстанавливается во время оплодотворения. Используя эти ограниченные данные, Вейсман предложил механическую модель клеточной дифференцировки – теорию зародышевой плазмы.

Суть этой теории сводилась к следующему. Во-первых, хромосомы яйца и спермия количественно и качественно на равных основаниях участвуют в образовании нового организма. Во-вторых, хро-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

40________________ ГЛАВА 8 _______________________________________________________________________________

Рис. 8.1. Схема, иллюстрирующая вейсмановскую теорию наследственности. Половая клетка даст начало дифференцирующимся соматическим клеткам тела (белые кружки) и половым клеткам (кружки с точками). (По Wilson, 1896.)

мосомы несут наследственные потенции этого нового организма и являются основой преемственности между поколениями. (Эмбриологи думали об этом еще за 15 лет до того, как вновь были открыты работы Менделя. Вейсман [Weismann. 1892, 1893] также выдвинул гипотезу, что эти ядерные детерминанты наследственности функционируют путем выработки веществ, которые становятся активными в цитоплазме!) Однако не все детерминанты хромосом попадают в каждую клетку зародыша, поскольку хромосомы делятся не поровну, а так, что в разные клетки попадают различные ядерные детерминанты. Вейсман. в прошлом военный врач, уподоблял эти детерминанты армейским бригадам. Если оплодотворенное яйцо должно нести полный набор детерминантов, то определенные клетки будут сохранять «образующие кровь» бригады, а другие клетки - «образующие мышцы» детерминанты. Только в ядрах тех клеток, которые предназначены стать гаметами (половыми клетками), будут оставаться все типы детерминантов. Ядра всех других клеток содержат только часть первоначальных типов детерминантов.

Таким образом, гипотеза Вейсмана предполагала непрерывность половой (зародышевой) плазмы и разнообразие соматических линий. Дифференцировка была обусловлена «сегрегацией ядерных детерминантов» в разных типах клеток и завершалась «архитектурой зародышевой плазмы», т.е. ядром половой клетки. Хромосомы, кажущиеся одинаковыми во всех клетках, должны были быть неравными во своим качествам. Линия половых клеток была полностью независимой от соматических клеток. Следовательно, признаки, приобретенные соматическими клетками, не могли наследоваться. Вейсман пытался экспериментально подтвердить эту модель, отрезая хвосты у новорожденных мышей на протяжении 19 поколений и в каждом новом поколении вновь получая мышей с хвостами. Эти данные были использованы им как аргумент в пользу того, что линия половых клеток изолирована от «нападения» (воздействия на нее) соматической ткани¹. Вейсмановская теория зародышевой плазмы в графической форме изображена на рис. 8.1. Он показывает непрерывность и бессмертие линии половых клеток в противоположность временному существованию взрослого организма; показывает, как отметил физиолог Майкл Фостер, что «тело животного есть по сути лишь носитель яйца». Вильсон (Wilson, 1896). подчеркивавший, что его замечательный учебник «Клетка в развитии и наследственности» выросла из гипотезы Вейсмана. говорил об историческом значении вейсмановской схемы:

«Смерть индивидуума не означает прекращении непрерывности серии делений клеток, благодаря которой продолжается жизнь расы. Индивидуум умирает, это верно, но половые клетки продолжают жить, как бы неся в себе традиции расы, от которой они произошли, и передавая их своим потомкам».

Вильгельм Ру: мозаичное развитие

Вейсман интуитивно чувствовал, что хромосомы являются носителями наследственности. Однако более важным было то, что он предложил гипотезу, которую можно было проверить очень быстро. Он считал, что первое деление дробления, разделяющее зародыш на будущие правую и левую половины, разделяет также «правые» и «левые» детерминанты

¹ К этому времени основной альтернативой была гипотеза пангенеза. Согласно этой гипотезе, которую сам Дарвин считал временной, каждая соматическая клетка содержит частички (пангены), которые мигрируют обратно в половые клетки, снабжая их признаками этой клетки, чтобы передать их потомству. По этой теории Вейсман должен был получить мышей с короткими хвостами. Наиболее убедительным доказательством теории пангенеза было сообщение физиолога Броун-Сскара и Уэстфала о том. что экспериментально вызванная эпилепсия у морских свинок может передаваться следующему поколению. Другие анекдотические «доказательства» наследования приобретенных признаков изобиловали ошибками (Thomson. 1907). Опыты Вейсмана с калечением мышей были подтверждены Босом (15 поколений). Копе (11 поколений) и Мантеццой и Розенталем (11 поколений). Недавно Томас Джакс, комментируя эти результаты, процитировал слова, которые произносит Гамлет: «Есть, стало быть, на свете божество, / Устраивающее наши судьбы/ По-своему.» (В Шекспир. Трагедии. Перев. с англ. Б. Пастернака. М.: РИПОЛ, 1993). Во всяком случае, теория пангенеза была сильно подорвана. Вейсман писал, что дарвиновская гипотеза – это «один из тех непрямых путей, которыми вынуждена идти наука, чтобы достичь истины».

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ПРОГРЕССИВНАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ _____________________________________________________ 41

Рис. 8.2. Попытка Ру показать мозаичное развитие. Разрушение одной клетки у 2-клсточного зародыша приводит к развитию только одной половины зародыша.

между двумя бластомерами. Это утверждение было проверено Вильгельмом Ру (W. Roux), молодым немецким эмбриологом, в прошлом учеником Эрнста Геккеля. Ру также был ревностным дарвинистом (в своей первой крупной работе по эмбриологии он высказал предположение о конкуренции между эмбриональными клетками), но, подобно Вейсману, чувствовал, что развитие должно изучаться с помощью аналитических методов. В 1888 г. Ру опубликовал результаты серии опытов, в которых он брал 2- и 4-клеточных зародышей лягушки и разрушал некоторые из клеток каждого зародыша горячей иглой. Из гипотезы Вейсмана следовало, что в этом случае образуется либо правая, либо левая половина зародыша. Ру и в самом деле получал половинные морулы, как то и предсказывал Вейсман (рис. 8.2). Развившиеся из них полунейрулы имели полный набор правой или левой стороны с одним нервным валиком, одной слуховой ямкой (плакодой) и т.д. На основе этих данных Ру пришел к выводу, что зародыш лягушки представляет собой мозаику самодифференцирующихся частей и очень вероятно, что каждая клетка получает свой набор детерминантов и соответственно этому дифференцируется. Этой серией опытов Ру начал свою программу по изучению механики развития (Entwicklungsmechanik), обосновывавшую физиологический подход к эмбриологии. Эмбриология. считал Ру, больше не должна быть просто служанкой эволюционных учений. Она должна выполнять свою роль независимой экспериментальной науки.

Ганс Дриш: регуляционное развитие

Никто не приветствовал этот экспериментальный подход к эмбриологии больше, чем другой ученик Геккеля – Ганс Дриш (H. Driesch). Дриш ставил перед собой цель объяснить развитие с позиций законов физики и математики. Первые его исследования были сходны с исследованиями Ру. Методически опыты Ру были опытами с нанесением дефектов; они отвечали на вопрос, как будут развиваться оставшиеся бластомеры, когда часть их разрушена. Дриш (1892) задумал расширить эти исследования, проделав опыты с изоляцией бластомеров. Он отделял друг от друга бластомеры морского ежа энергичным встряхиванием (или позже помещением их в бескальциевую морскую воду). К удивлению Дриша, каждый из бластомеров двуклеточного зародыша развивался в полную личинку. Точно также, если Дриш разделял бластомеры 4и 8-клеточных зародышей, то некоторые из клеток образовывали целые личинки, называемые плутеусами (рис. 8.3). Этот результат поразительно отличался от того, что предсказывали Вейсман или Ру. Вместо самодифференцировки в будущую часть зародыша каждый бластомер мог регулировать свое развитие и давать начало целому организму. Это явление было названо регуляционным развитием.

Регуляционное развитие было продемонстрировано Дришем и в других опытах. У морских ежей плоскости двух первых делений дробления являются меридиональными, тогда как третье деление проходит по экватору яйца, разделяя зародыш на четыре верхние и четыре нижние клетки (см. рис. 3.3). Дриш (1893) изменял направление третьего деления, слегка сжимая ранний зародыш между двумя стеклянными пластинками; в результате третье деление также проходило в меридиональной плоскости, как и первые два. Если затем давление ослабляли, то четвертое деление дробления было экваториальным. Эта процедура вызывала перегруппировку ядер, так что ядро, которое в норме должно было оказаться в области, предназначенной формировать энтодерму, теперь попадало в область презумптивной эктодермы. Ядра, которые должны были обра-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

42________________ ГЛАВА 8 _______________________________________________________________________________

Рис. 8.3. Опыты Дриша. доказавшие существование развития по регуляционному типу. А. Нормальная личинка морского ежа – плутеус. Б. Более мелкие, но нормальные плутеусы: каждый из них развился из одного бластомера. полученного путем разделения 4-клеточного зародыша на отдельные бластомеры. (Все личинки зарисованы в одном масштабе.) Обратите внимание на то. что все 4 личинки, происшедшие из этих бластомеров (Б), не идентичны, несмотря на их способность образовывать все необходимые типы клеток. (По Hö rstadius, Wolsky. 1936.)

зовывать дорсальные структуры, обнаруживались в вентральных клетках (рис. 8.4). Если бы в данном случае происходила сегрегация ядерных детерминантов, то у развившегося из этих клеток зародыша все структуры должны были располагаться в причудливом беспорядке. Однако Дриш получил из этих зародышей нормальных личинок.

Результаты этих опытов оказались очень важными как для эмбриологии, так и лично для Дриша Во-первых. Дриш показал, что «проспективная потенция» изолированного бластомера (т.е. тот тип клеток, который мог из него произойти) шире, чем его «проспективная судьба» (т.е. те типы клеток, которые должны формироваться из этого бластомера при неизменном ходе его развития). Согласно же Вейсману и Ру. проспективная потенция и проспективная судьба бластомера должны быть идентичными. Во-вторых. Дриш пришел к выводу, что зародыш морского ежа представляет собой «гармоничную эквипотенциальную систему». Система эта гармонична потому, что все ее потенциально независимые части функционируют вместе, формируя единый организм. В-третьих, судьба ядра зависела исключительно от его положения в зародыше. Дриш (1894) выдвинул гипотезу о серии событий, продвигающих развитие вперед посредством взаимодействия ядра и цитоплазмы:

«Поскольку каждая клетка содержит ядро, она на протяжении онтогенеза несет в себе всю сумму зачатков; поскольку она содержит специфическое

Рис. 8.4. Схема, иллюстрирующая результаты опыта Дриша со сдавливанием дробящихся зародышей для изменения распределения ядер. А. Нормальное дробление у зародыша морского ежа в возрасте от 8 до 16 клеток; вид с анимального полюса (вверху) и сбоку (внизу). Б. Аномальное положение плоскостей деления бластомеров, формирующееся под давлением; вид с анимального полюса и сбоку. (По Huxley, de Beer, 1934.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ПРОГРЕССИВНАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ__________________________________________________ 43

цитоплазматическое клеточное тело, это позволяет ей реагировать только на специфические воздействия... Когда в какой-либо клетке активируется ядерный материал, цитоплазма этой клетки, которая влияла на ядро, сама в свою очередь оказывается под влиянием ядра и изменяется; таким образом, устанавливается основа для нового элементарного процесса, который является не только результатом, но также и причиной изменений».

Эта удивительно современная концепция ядерноплазменного взаимодействия и равноценности ядер оказалась не по силам Дришу. Рассматривать зародыш как физическую машину было уже невозможно, ведь зародыш можно было разделить на части, каждая из которых была способна воссоздать целый организм. Другими словами. Дриш пришел к убеждению, что развитие не может быть объяснено физическими силами. И чтобы объяснить, каким образом происходит развитие, он был вынужден призвать на помощь жизненную силу – энтелехию («внутреннюю силу, направляющую к цели»). В сущности, зародыш должен быть наполненным внутренним духом и мудростью, чтобы осуществить свои цели, несмотря на препятствия, которые ставят на его пути эмбриологи. Неспособный объяснить свои результаты с позиций физики его времени. Дриш отказался от изучения физиологии развития, стал профессором философии и продолжал провозглашать витализм вплоть до своей смерти в 1941 г.

Различия в опытах Ру и Дриша суммированы в табл. 8.1. Различия между опытами по нанесению дефектов и изоляции, а также важность взаимодействий, обеспечиваемых разрушенными бластомерами. были выяснены в опытах Мак-Клендона (McClendon. 1910), показавших, что изолированные бластомеры лягушки ведут себя точно так же. как изолированные бластомеры морского ежа. Следовательно, мозаичное развитие бластомеров лягушки в исследованиях Ру было артефактом, полученным в опытах с нанесением дефекта. Что-то в мертвом бластомере или на нем все еще информировало живые клетки о его существовании. Мы видели также, что ранние бластомеры млекопитающих обладают регуляционным типом развития. Как уже обсуждалось в гл. 3. каждый изолированный бластомер внутренней клеточной массы у мыши способен генерировать целую фертильную мышь. Такие факты, как слияние двух и более ранних зародышей мыши в один нормальный зародыш (см. рис. 3.3) или рождение идентичных близнецов, также свидетельствуют о том. что ранние бластомеры млекопитающих способны к регуляции. Поэтому, хотя Вейсман и Ру были пионерами исследований в области физиологии развития, их предположение о том, что причиной дифференцировки является сегрегация ядерных детерминантов, вскоре было опровергнуто.

Свен Гёрстадиус: потенции и градиенты в ооците

Но и Дриш оказался прав не на 100%. Как мы видели в предыдущей главе, существует много животных, развитие которых представляет собой главным образом мозаику самодифференцирующихся частей. Более важно, однако, что даже зародыши морского ежа не представляют собой коллекцию полностью эквипотенциальных клеток. Шведский биолог Свен Гёрстадиус в серии опытов, проведенных с 1928 по 1935 г.. отделял тонкими стеклянными иглами разные слои ранних зародышей морского ежа и наблюдал их последующее развитие (Hö rstadius, 1928, 1939). Если он разделял 8-клеточный зародыш пополам по меридиану, проходящему через анимальный и вегетативный полюсы, то из обеих половин развивались личинки плутеусы, как и предсказывал Дриш. Но если зародыши на той же стадии разделяли пополам по экватору (т.е. на анимальную и вегетативную половины), то ни одна из частей не развивалась в нормальную личинку (рис. 8.5). Анимальная половина превращалась в полый шар, образованный реснитчатыми

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

Рис. 8.5. Ранняя асимметрия у зародышей морского ежа. А. Если четыре анимальных бластомера отделить от четырех вегетативных и дать возможность каждой половине развиваться по отдельности, то анимальные клетки формируют снабженную ресничками задержанную бластулу, а вегетативные клетки – личинку с расширенной кишкой, Б. Если 8-клеточный зародыш разделить так. чтобы каждая половина содержала анимальные и вегетативные клетки, то развиваются мелкие, нормального вида личинки.

Рис. 8.6. Асимметрия в яйце морского ежа. А. Когда Герстадиус разделял яйцо морского ежа в меридиональной плоскости так. что обе половины (мерогоны) содержали анимальную и вегетативную цитоплазму, развивались мелкие, нормального вида плутеусы. Б. После того как яйцо морского ежа было разделено на анимальную и вегетативную половины и обе половины оплодотворены, из анимальной половины развивалась покрытая ресничками задержанная бластула, а из вегетативной - плутеус с расширенной кишкой.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ПРОГРЕССИВНАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ _____________________________________________________ 45

эпидермальными клетками (называемый Dauerblastula – продолженная или задержанная бластула), а вегетативная половина развивалась в слегка аномальный зародыш с расширенной кишкой. Гёрстадиус смог повторить эти результаты, разрезая пополам яйца морского ежа и оплодотворяя обе половины по отдельности. У морских ежей фрагменты яиц (мерогоны) могут делиться и развиваться. даже если они имеют гаплоидное ядро. Если спермий проникает в половину, не содержащую гаплоидного ядра яйца, то мерогон также будет развиваться (рис. 8.6). Ко|да яйцо разрезали меридионально, из обеих половин яйца развивались нормальные зародыши. Однако когда яйцо разрезали экваториально, то после оплодотворения обеих половин из фрагментов формировались или окаймленный ресничками анимальный шарик, или зародыш с расширенной вегетативной кишкой. Следовательно, даже зародышам морского ежа, по-видимому, в некоторой степени присущ мозаицизм, по меньшей мере по анимально-вегетативной оси.

Эти наблюдения побудили Гёрстадиуса осуществить, пожалуй, один из наиболее поразительных опытов в истории эмбриологии. Сначала (1935) он проследил нормальное развитие шести слоев клеток у 64-клеточного зародыша морского ежа. Как показано на рис. 8.7. А. анимальные клетки и первый вегетативный слой (Вег ₁) в норме образуют эктодерму, второй вегетативный слой (Вег ₂) дает начало энтодерме и части личиночной мезодермы, а из микромеров развивается мезодермальный скелет.

Затем Гёрстадиус удалял у 64-клеточного зародыша оболочку оплодотворения, отделяя слои один от другого тонкими стеклянными иглами, и рекомбинировал их в разных сочетаниях. Изолированное анимальное полушарие превращалось в задержанную бластулу из эктодермальных клеток, покрытых ресничками (рис. 8.7. Б). Такой зародыш был назван анимализированным. Если Гёрстадиус комбинировал анимальное полушарие со слоем Вег ₁ (рис. 8.7. В), то получившаяся в результате личинка была менее анимализированной: у нее было подавлено образование ресничек и формировалась часть кишки. Если же анимальное полушарие было соединено со слоем Вег ₂ (рис. 8.7. Г), то развивалась личинка, выглядевшая нормальной. В этой комбинации слой Вег₂, который в норме формирует только архентерон и его производные, теперь формировал также скелетные структуры. Сходным образом, когда анимальную половину комбинировали только с микромерами (рис. 8.7. Д), формировался маленький, выглядевший нормальным плутеус, но в этом случае энтодерма была полностью образована анимальными клетками. У такого плутеуса кишка возникала из клеток, которые в норме должны были образовать снабженную ресничками эктодерму. Эти опыты показали, что даже на 64-клсточной стадии анимальные клетки сохраняют генетический потенциал к образованию клеток кишки. Еще более важным было то, что способность к подавлению «анимализации» носит градиентный характер. Микромеры были более сильными «вегетализаторами», чем слой Вег ₂: но слой Вег ₂ в свою очередь был сильнее, чем слой Вег ₁.

Следующая серия опытов Гёрстадиуса подтвердила существование анимализирующего фактора, который также распределен по градиенту. Микромеры комбинировали с каждым слоем 64-клеточного зародыша по отдельности. Изолированный слой Ан ₁(рис. 8.8. А) должен был образовывать задержанную бластулу. Когда к этому слою добавляли различное число изолированных микромеров, причем число их постоянно увеличивали, развивались все более полные зародыши. Комбинация только слоя Ан ₁. с четырьмя микромерами приводила к образованию нормального плутеуса. Из слоя Ан ₂, нормальный плутеус развивался уже при комбинации с двумя микромерами (рис. 8.8. Б), а добавление четырех микромеров приводило к аномальному увеличению энтодермальных структур. Из слоя Вег ₁без добавления микромеров образуется также только задержанная бластула. Однако добавление даже одного микромера вызывало резкое увеличение кишки (рис. 8.8. В), а изолированный слой Вег ₂вообще имел тенденцию к вегетализации без добавления каких-либо микромеров (рис. 8.8. Г). Таким образом, существует, по-видимому, градиент анимализации, усиливающийся по направлению от Ан ₁, к микромерам.

Наиболее логичным объяснением этих результатов было предположение, что существуют два противоположно направленных градиента: вегетализирующий градиент с максимумом активности на вегетативном полюсе и анимализирующий градиент с максимальной активностью на анимальном полюсе. Именно такую систему двойных градиентов предложил старший коллега Гёрстадиуса Дж. Рунстрем (Runnstrom. 1929). Поскольку для развития более важны относительные, а не абсолютные концентрации различных веществ, рекомбинация бластомеров из двух полюсов восстанавливает все промежуточные значения градиентов. Сходным образом промежуточные клетки, еще содержащие максимум и минимум для обоих градиентов, также могут дать начало нормальному плутеусу (рис. 8.9). Эта модель двойного градиента оказалась очень полезной для объяснения других рекомбинационных опытов. Например, если микромеры из вегетативного полюса пересаживали в область, близкую к центру 32-клеточного зародыша, то они инвагинировали в бластоцель хозяина, где вызывали формирование хорошо развитого вторичного архентерона

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

46________________ ГЛАВА 8 ______________________________________________________________________________

Рис. 8.7. Обнаружение вегетализирующего градиента в опытах Гёрстадиуса. А. Судьба каждого клеточного слоя зародыша морского ежа на стадии 64 клеток, прослеженная от бластулы до стадии плутеуса. Различные клеточные слои обозначены разными оттенками серого цвета, а микромеры – черным (как на рис. 4.1). Б. Судьба изолированной анимальной половины. В Рекомбинация анимальной половины со слоем клеток Вег 1 . Г. Рекомбинация анимальной половины со слоем клеток Вег 2. Д. Анимальная половина и микромеры. (По Hö rsudius, 1939.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ПРОГРЕССИВНАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ _____________________________________________________ 47

Рис. 8.8. Обнаружение анимализирующего градиента в опытах Гёрстадиуса. Каждый слой 32-клеточного зародыша морского ежа был изолирован и затем рекомбинирован с 0, 1, 2 или 4 микромерами. Чтобы из клеток, происходящих из слоя Ан 1, сформировался нормальный плутеус, необходимы все 4 микромера (А), но чтобы плутеус образовался из слоя Ан2. достаточно двух микромеров. Слой Вег1 развивается в вегетализированную личинку уже с одним микромером (В). а в клетках слоя Вег2 вообще отсутствуют анимализирующие свойства, достаточные, чтобы сформировался нормальный плутеус (Г) (По Horstadius, 1935.)

(рис. 8.10). Если же микромеры имплантировали на анимальный полюс, то формировалась очень маленькая вторичная кишка. Вместе с тем из зародышей не удалось выделить ни вегетативный, ни анимальный факторы. Ингибиторы белков (тяжелые металлы, NaSCN, краситель синий Эванса). по-видимому, уменьшали вегетализирующий градиент и таким способом анимализировали зародыш. Ингибиторы дыхания (CO, KCN, NaN₃, Li) вегетализировали зародыш. Так, Убишу (Ubisch. 1929) удалось получить нормальный плутеус из анимальной половины, которая развивалась в растворе хлористого лития. Литий, по-видимому, ослабляет анимальную часть градиента в пределах анимальных клеток и тем самым способствует сбалансированному развитию этого полушария.

Таким образом, мы имеем модель регуляционного развития, основанную на относительных концентрационных градиентах в ооците. Когда анимальные клетки комбинируют только с микромерами, формируется нормальный плутеус с клетками кишки, происходящими из анимальных клеток, которые в норме должны были формировать эктодерму. Следовательно, и на более поздних стадиях развития потенции клеток все еще шире, чем их судьба. Но из одних анимальных клеток теперь образуется только анимализированная бластула, так что способность одной клетки дать начало целой личинке исчезла. Другими словами, ее потенции стали ограниченными. Любая клетка с определенным соотношением анимальных и вегетативных веществ будет продуцировать определенный тип клеток. Следовательно, клетки анимального полюса с более высоким отношением анимального фактора к вегетативному в норме будут образовывать эктодермальную ткань. Однако некоторые ани-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

Рис 8.9. Развитие· плутеуса из наружных и промежуточных клеток 32-клеточного зародыша морского ежа. А. К слою мезомеров (Ан1 + Ан2) добавлены микромеры. Б. Слой Ан 2с добавлением макромеров (будущие слои Вег 1и Вег 2 ), но без двух крайних слоев (Ан1 и микромеры). В обоих случаях образуются плутеусы. Каждый рисунок в нижнем ряду представляет собой гипотетический градиент. (По Czihak, 1971.)

Рис. 8.10. А. Микромеры, взятые из области вегетативного полюса (обозначены черным), пересажены в область между анимальной и вегетативной половиной 32 клеточного зародыша. Б. Микромеры инвагинируют в бластоцель. В. Формируется вторичный архентерон и в конечном счете плутеус (Г), имеющий два архентерона. Д. Эти два отдельных архентерона позже сливаются в одну большую кишку. (По Hö rstadius, I935.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ПРОГРЕССИВНАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ ______________________________________________________ 49

мальные клетки, рекомбинированные с сильным источником вегетативного фактора, будут формировать ткань кишки. Если зародыш разделен таким образом, что каждая половина содержит полный анимальный и вегетативный градиенты (т.е. разделение произведено по меридиану, проходящему вдоль анимально-вегетативной оси), то формируется полная личинка. Бластомеры остаются способными к регуляции до тех пор, пока не будут формироваться исключительно из анимальной или вегетативной цитоплазмы. Поэтому неудивителен тот факт, что после 32-клсточной стадии большая часть бластомеров по отдельности более не может дать начало целой личинке (Morgan. 1895), а микромеры с 16-клеточной стадии уже неспособны к этому (Hagstrom. Lonning, 1965: Okazaki. 1975). Даже для зародыша, развитие которого является регуляционным, наступает время, когда потенции его клеток становятся ограниченными.

Ганс Шпеман: прогрессивная детерминация эмбриональных клеток

В предыдущем разделе главы были приведены данные о регуляционном типе развития. Мы отметили два главных аспекта регуляции: 1) потенция изолированных бластомеров в эмбриогенезе шире, чем их нормальная судьба, и 2) бластомеры. перемещенные в другую область зародыша, развиваются согласно их новому положению. Оба этих явления характерны для ранних стадий дробления морского ежа. Однако впоследствии бластомеры морского ежа становятся коммитированными к их различным проспективным значениям. Гёрстадиусу удалось связать ограничение потенций с ориентацией плоскости делений дробления, поскольку бластомеры могли регулировать развитие лишь до тех пор, пока они имели достаточно материала как из анимальной, так и из вегетативной частей яйца. В 1918 г. Ганс Шпеман (H. Spemann) из Фрайбургского университета обнаружил, что сходная ситуация наблюдается и в яйце тритона. Опыты, с помощью которых он и его коллеги анализировали это явление в течение более чем 20 лет. заложили основу большей части наших знаний о физиологии развития и обусловили присуждение Шпеману Нобелевской премии в 1935 г.

Шпеман, подобно Ру и Дришу, решил проверить гипотезу Вейсмана и с помощью остроумной методики доказал, что ядра ранних бластомеров тритона идентичны, т. е. каждое из них способно обеспечить развитие целой личинки. Пользуясь волоском ребенка в качестве лигатуры, он перевязывал им яйцо тритона вскоре после оплодотворения в плоскости первого деления дробления. Затем он несколько стягивал петлю так, что все деления ядер происходили лишь в одной из половин. Наконец на стадии 16 бластомеров одно ядро смогло проскользнуть через перетяжку в безъядерную половину. Дробление начиналось и в этой половине, а петлю, накинутую на яйцо. Шпеман стягивал все сильнее, пока не разделял яйцо на две изолированные половины. В результате развивались два зародыша-близнеца, причем один был немного старше другого (рис. 8.11). Результаты этого опыта позволили Шпеману сделать вывод, что ядра ранних зародышей амфибий идентичны и каждое способно обеспечить развитие целого организма. В этом отношении бластомеры амфибий были сходны с бластомерами морских ежей.

Однако, когда Шпеман проделал сходный опыт с перетягиванием яйца также лонгитудинально, но перпендикулярно к плоскости первого деления дробления (т.е. разделял яйцо не на левую и правую половины, а на будущую спинную и брюшную стороны), он получил совершенно другой результат! По обе стороны от лигатуры ядра продолжали делиться, но лишь из клеток одной стороны образовалась нормальная личинка. Из другой половины возникала только неорганизованная масса ткани, названная Шпеманом Bauchstü ck «кусок живота». Эта масса тканей представляла собой шарик эпидермальных клеток (эктодерма), содержащий внутри кровь и мезенхиму (мезодерма) и клетки кишки (энтодерма), но в нем не было дорсальных структур, таких, как нервная система, хорда или сомиты (рис. 8.12).

Почему описанные выше два опыта дали разные результаты? Не могло ли это быть вызвано тем, что при первом делении яйца, когда плоскость деления проходила перпендикулярно к нормальной плоскости первого деления дробления, некоторые цитоплазматические вещества неравномерно распределялись по двум половинам? К счастью, яйцо тритона оказалось очень удобным для получения ответа на этот вопрос. Как уже говорилось в гл. 2 и 4, в яйцах амфибий после оплодотворения происходит резкое смещение кортикального слоя цитоплазмы и у некоторых видов амфибий такое движение приводит к образованию серого серпа в области, прямо противоположной месту проникновения спермия в яйцо. Кроме того, плоскость первого деления дробления обычно делит эту область поровну между двумя бластомерами. из которых, если их отделить друг от друга, развиваются две нормальные личинки. Однако, если плоскость первого деления отклоняется от середины серого серпа (в редких случаях спонтанно или в опыте, в котором исследователь перетягивает яйцо волосяной петлей перпендикулярно плоскости нормального деления), то материал

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

50________________ ГЛАВА 8 _______________________________________________________________________________

Рис. 8.11. Опыты Шпемана. показавшие равноценность ядер у зародышей тритона в период дробления. А Если на оплодотворенное яйцо тритона Trituras vulgaris (= T. taeniatus) накладывали лигатуру, то ядро оказывалось в одной половине зародыша. Когда дробление в этой половине доходило до стадии 8 бластомеров. безъядерная половина оставалась неразделенной. Б. На 16-клеточной стадии в эту половину перешло одно ядро, и лигатура была стянута еще сильнее – до полного разделения двух половин в яйцевой оболочке. В. Через 140 сут каждая половина яйца развилась в нормального зародыша. (По Spemann, 1938.)

Рис. 8.12. Асимметрия в яйце амфибий. А. Если плоскость первого деления дробления делит яйцо на две половины, в каждую из которых попадает половина серого серпа, то оба бластомера после их изоляции друг от друга развиваются в нормальных зародышей. Б. Если весь серый серп попадает в один из двух бластомеров, то нормальный зародыш образуется только из бластомера, содержащего серый серп. Из другого формируется масса неорганизованной ткани, лишенной дорсальных структур. (По Spemann, 1938.)

серого серпа может попасть только в один из двух бластомеров. Шпеман обнаружил, что когда эти два бластомера разделены полностью, нормально развивается только тот бластомер, который содержит материал серого серпа.

Отсюда следует, что в области серого серпа содержится, по-видимому, какой-то фактор, весьма существенный для правильного развития зародыша. Но как этот фактор действует? Какую роль играет в нормальном развитии? Наиболее важный ключ к решению этого вопроса дает судьба области серого серпа. Показано, что из нее образуются клетки, которые инициируют гаструляцию и формируют спинную губу бластопора. Клетки спинной губы бластопора (см. гл. 4) запрограммированы, чтобы инвагинировать внутрь зародыша и, таким образом, начинать гаструляцию и формирование архентерона. Поскольку вес будущее развитие амфибий зависит от взаимодействия клеток, перемещающихся в процессе гаструляции. Шпеман предположил, что материал серого серпа играет решающую роль в инициации гаструляции и что в период гаструляции в развитии зародыша происходят кардинальные изменения.

В 1918 г. Шпеман показал, что в период гаструляции действительно резко меняется потенция клеток. Он обнаружил, что клетки ранней гаструлы еще не детерминированы к их конечной дифференцировке, тогда как на стадии поздней гаструлы судьба клеток уже определена. Шпеман произвел пересадки тканей на стадии ранней гаструлы у двух различно пигментированных видов тритонов (рис. 8.13). Если участок презумптивного эпидермиса трансплантировали в область будущей нервной пластинки, то он превращался в нервную ткань. Λ если клетки презумптивной нервной пластинки пересаживали в область будущего эпидермиса живота, то они становились эпидермальными (табл. 8.2). Следовательно, клетки ранней гаструлы тритона не были коммитированы к специфическому типу дифференцировки. Их проспективные потенции были все еще шире их проспективного значения. Принято говорить о зависимом развитии этих клеток, поскольку их судьба зависит от их локализации в зародыше. Однако, когда такие же самые гетеропластические (межвидовые) пересадки были осуществлены на стадии поздней

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

______________________ ПРОГРЕССИВНАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ ______________________________________________________________ 51

Рис. 8.13. Детерминация эктодермы в период гаструляции у тритона. Презумптивную нейральную эктодерму от одного зародыша тритона пересаживали другому зародышу в область, которая в норме становится эпидермисом. А. Если пересадку производили на стадии ранней гаструлы, то презумптивная нервная ткань развивалась в эпидермис и была видна только одна нервная пластинка. Б. Если такую же операцию проводили на стадии поздней гаструлы, тο презумптивные нервные клетки формировали нейральную ткань и у хозяина формировались две нейральные области (По Saxen, Toivonen, 1962 .)

гаструлы. Шпеман получил совершенно другой результат. Вместо того, чтобы регулировать собственную дифференцировку в соответствии со своим новым положением, трансплантированные клетки обнаружили независимое (или автономное) развитие. Их проспективное значение уже было зафиксировано, и клетки развивались независимо от своего нового положения в зародыше. Презумптивные нервные клетки теперь образовывали нервную ткань даже в том случае, когда их помещали в область будущего эпидермиса, а презумптивный эпидермис формировал кожу, даже будучи помещенным в область презумптивной нервной трубки. Следовательно, за время, прошедшее от стадии ранней гаструлы до стадии поздней гаструлы. потенции этих групп клеток сузились, так что они

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

52________________ ГЛАВА 8 ________________________________________________________________________

смогли следовать только одному своему специфическом) пути дифференцировки. Эти клетки теперь можно назвать детерминированными. Под детерминацией подразумевается коммитирование (предназначение) клеток к тому, чтобы в конечном счете дифференцироваться именно в этот, а не в какой-либо иной специфический тип. Поэтому на стадии поздней гаструлы клетки анимального полюса на той стороне, где закладывается спинная губа бластопора, коммитированы (детерминированы) к образованию нервной ткани в любом месте, куда бы они ни попадали (включая чашку Петри). Их развитие уже не поддается регуляции, и они не могут превратиться в клетки других типов. Следует отметить, что критерием для определения состояния детерминации служит поведение клеток в условиях опыта. Никаких явных изменений в клетках не происходит, и еще не видно никаких признаков их дифференцировки. Молекулярные основы детерминации остаются одной из главных и пока нерешенных проблем биологии развития.

Ганс Шпеман и Гильда Мангольд: первичная эмбриональная индукция

Ганс Шпеман и Гильда Мангольд в 1924 г. опубликовали результаты наиболее эффектных опытов по трансплантации. Они показали, что единственной самодифференцирующейся областью на стадии ранней гаструлы является область спинной губы бластопора и что она действительно инициирует гаструляцию и эмбриогенез в окружающей ткани. В этих опытах Шпеман и Мангольд использовали зародышей двух по-разному пигментированных видов тритона: сильно пигментированного обыкновенного тритона [Triturus vulqaris (taeniatus)] и непигментированного (светлого) гребенчатого тритона (Triturus cristatus)]. Препарируя зародышей. Шпеман и Мангольд по окраске с легкостью могли различить ткани донора и хозяина. Спинную губу бластопора (материал дорсальной краевой зоны), взятую от зародышей гребенчатого тритона на стадии ранней гаструлы, пересаживали зародышу обыкновенного тритона, находящемуся на той же стадии, в область, предназначенную стать брюшным эпидермисом (рис. 8. 14. А). В отличие от других тканей гаструлы, которые развивались согласно своему новому положению, губа бластопора донора не стала брюшным эпидермисом. Она инвагинировала, как делала бы это на своем обычном месте (обнаруживая тем самым свою детерминированность), и исчезала под клетками вегетативного полушария. Светлоокрашенные ткани донора затем продолжали дифференцироваться в хордомезодерму и другие мезодермальные структуры, образова-

Рис. 8.14. Самодифференцировка материала спинной губы бластопора. Спинную губу бластопора, взятую у зародыша на стадии ранней гаструлы (А), пересаживали другому такому же зародышу в область, которая в норме должна стать брюшным эпидермисом. Б. Трансплантат инвагинирует и формирует второй архентерон, а затем вторичные осевые структуры. В образовании этой новой нервной трубки, хорды и сомитов участвуют как клетки донора (на рисунке обозначены черным цветом), так и хозяина (обозначены белым цветом). В. В результате формируется вторичный зародыш, соединенный с зародышем-хозяином

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ПРОГРЕССИВНАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ _________________________ 53

Рис. 8.15. Индукция новых осевых структур зародыша гензеновским узелком. А. Область гензеновского узелка, взятая у зародыша утки, имплантирована хозяину - куриному зародышу. Б. На месте трансплантата индуцировалась дополнительная нервная трубка (По Waddington, 1933.)

ние которых соответствовало собственной судьбе материала спинной губы бластопора. После того как сформировались эти вторичные осевые структуры, клетки хозяина начали также принимать участие в образовании нового зародыша, давая начало органам, которыми они никогда не должны были стать. Например, сомиты содержали как бесцветную (донорскую), так и пигментированную (хозяйскую) ткань. Но наиболее поразительным оказалось то, что хордомезодерма была способна, взаимодействуя с лежащими над ней эктодермальными клетками, индуцировать образование всей нервной пластинки. В некоторых случаях «лицом к лицу» с зародышем-хозяином формировался вторичный зародыш (рис. 8.14. А). Эти методически трудные опыты были недавно повторены с использованием ядер-маркеров: результаты опытов Шпемана и Мангольд подтвердились (Gimlich, Cook, 1983; Recanzone, Harris, I985)¹.

Процесс, посредством которого одна область зародыша, взаимодействуя с другой, возбуждает эту область развиваться в направлении ином, чем она развивалась бы без этого воздействия, называют индукцией. Поскольку в эмбриогенезе происходят самые разнообразные многочисленные индукционные взаимодействия, это ключевое взаимодействие, в котором дорсальная мезодерма индуцирует эктодерму к дифференцировке в нейральные структуры, получило название первичной эмбриональной индукции ². Область спинной губы бластопора Шпеман назвал организатором. Теперь известно (главным образом благодаря Шпеману и его ученикам), что взаимодействия между хордомезодермой и эктодермой недостаточно, чтобы «организовать» целого зародыша. Точнее, это взаимодействие инициирует серию индукционных процессов. Мы также знаем теперь, что спинная губа бластопора сходным образом «организует» вторичного зародыша у Amphioxus (ланцетника), круглоротых и различных видов амфибий. Передняя часть первичной полоски (т.е. гензеновский узелок область, в которой начинается гаструляция у птиц и млекопитающих) действует сходным образом, инициируя образование вторичных зародышей у этих классов позвоночных (Waddington, 1933. рис. 8.15).