Гибридизация нуклеиновых кислот

Современные представления о генах эукариот и их РНК-продуктах были сформулированы главным образом на основе опытов по гибридизации нуклеиновых кислот. Методика гибридизации включает отжиг одноцепочечных фрагментов РНК и ДНК, позволяющий комплементарным цепям образовывать двухцепочечные гибриды. Например, если нуклеиновые кислоты разрезаны на небольшие фрагменты и каждый фрагмент диссоциирован на отдельные нити (т.е. денатурирован), то каждая нить по прошествии достаточного времени может найти комплементарного партнера и соединиться с ним. Условия ренатурации должны быть таковы, чтобы специфические гибриды комплементарных цепей сохранялись, а неспецифические гибриды диссоциировали. Обычно эти условия обеспечиваются изменением температуры или ионной силы раствора, в котором проходит ренатурация (Wetmur, Davidson, 1968).

Сходным образом следует ожидать, что РНК, синтезируемая на каком-либо участке ДНК, будет связываться с цепью, на которой она синтезирована. Таким образом, предполагается, что РНК специфически гибридизуется с геном, который ее кодирует. Для определения уровня гибридизации одну из цепей нуклеиновой кислоты обычно метят радиоактивным изотопом. Возьмем для примера один эксперимент. Нерадиоактивную ДНК из печени лягушки можно денатурировать (ее цепи разделяются в щелочи) и иммобилизовать на нитроцеллюлозном фильтре. Радиоактивную РНК можно получить при введении радиоактивных предшественников РНК в другую лягушку или в культуру клеток лягушки.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ _______________ 81

Затем выделяют рибосомы и экстрагируют из них радиоактивную рибосомную 28S-PHK (рРНК), которую добавляют к фильтрам с ДНК. Полагают, что радиоактивная РНК будет связываться только с теми участками ДНК. которые содержат гены для 28S-pPHK. Количество связавшейся РНК можно определить, измерив радиоактивность фильтров после удаления несвязавшейся РНК.

Схема такого опыта и его результаты показаны на рис. 10.1. ДНК выделяли из нормальных головастиков с двумя ядрышками на клетку, а также из гомозиготных мутантов, полностью лишенных ядрышек, и гетерозиготных головастиков с одним ядрышком на клетку (Wallace, Birnstiel, 1966). ДНК, выделенную из каждой группы, денатурировали. По 50 мкг ДНК наносили на каждый из нескольких десятков бумажных фильтров: в одной группе фильтров – денатурированная ДНК из головастиков дикого типа; во второй – ДНК из мутантных головастиков; в третий – ДНК из гетерозиготных головастиков. Затем различные количества радиоактивной 28S-pPHK гибридизовали с тремя типами ДНК на фильтрах. На одни фильтры наносили небольшие количества радиоактивной ДНК, на другие – большие количества. Оказалось, что радиоактивная рРНК хорошо связывается с ДНК из нормальных головастиков, насыщая в конечном счете всю доступную ДНК. С ДНК из клеток головастиков, лишенных ядрышек, рРНК не связывалась, тогда как ДНК из гетерозиготных головастиков связывала лишь половину того количества рибосомной РНК, которое связывалось с ДНК из нормальных головастиков. Таким образом, было показано, что гены 28S-pPHK в геноме головастиков транскрибируются в области ядрышек.

Одна из технических трудностей, связанных с гибридизацией нуклеиновых кислот, заключается в сложности получения молекул РНК с высокой радиоактивностью. Это затруднение можно преодолеть с помощью выделения РНК и получения комплементарной ДНК-копии (кДНК) в присутствии радиоактивных предшественников. Она может быть синтезирована в пробирке, содержащей РНК, короткий фрагмент ДНК, называемый праймером (затравкой), радиоактивные предшественники ДНК и вирусный фермент – обратную транскриптазу. Этот фермент способен синтезировать ДНК на РНК-матрице (рис. 10.2). Поскольку ДНК синтезируется in vitro, проблем с разведением радиоактивных предшественников не возникает. Кроме того, такая кДНК может гибридизоваться как с геном, синтезирующим РНК (хотя и с некодирующей цепью), так и с самой РНК. Это оказывается чрезвычайно полезным при регистрации небольших количеств специфических РНК.