Клонирование генов

Сравнительно недавно, используя методы гибридизации нуклеиновых кислот, биологам развития на основе подхода, названного клонированием генов, удалось выделить отдельные гены. Если бы кто-то захотел изолировать, например, отдельный ген человека, то он столкнулся бы с неразрешимыми проблемами. Геном человека содержит ДНК в количестве, достаточном для кодирования примерно 2 х 10⁵ генов размером около 15 000 пар оснований каждый. Обычные биохимические процедуры не позволяют отделить один ген от всех остальных. Однако техника клонирования генов позволяет выделить специфические участки ДНК, а также провести их амплификацию до огромного числа копий.

Первый этап в этой процедуре заключается в разрезании ядерной ДНК на различные фрагменты. Это осуществляется с помощью инкубации ДНК в присутствии рестрикционной эндонуклеазы (обычно называемой «рестриктазой»). Эти эндонуклеазы являются, как правило, бактериальными ферментами, которые узнают специфические последовательности ДНК (табл. 10.1) и расщепляют ДНК в этих участках (Nathans, Smith, 1975). Например, если ДНК человека инкубируют с ферментом Bam H1(выделенным из Bacillus amyloliquifaciens, штамм H), то ДНК разрезается в каждом участке, где имеется последовательность ГГАТЦЦ. Продуктом реакции являются различные по длине фрагменты ДНК. содержащие Г на одном конце и ГАТЦЦ на другом (рис. 10.3).

Следующий этап – включение полученных фрагментов ДНК в векторы для клонирования. Эти векторы представляют собой кольцевые молекулы ДНК, которые реплицируются в бактериальных клетках независимо от бактериальной хромосомы. Обычно используются плазмиды, устойчивые к тем или иным лекарственным препаратам, или специально модифицированные вирусы, которые особенно эффективны в случае клонирования больших фрагментов ДНК. Подобную плазмиду можно сконструировать таким образом, чтобы она содержала только один чувствительный к Bam H1сайт. Ее можно раскрыть при инкубации с данной рестриктазой. После раскрытия она смешивается с фрагментированной ДНК. Во многих случаях нарезанные фрагменты ДНК оказываются включенными в векторы благодаря комплементарности их концов открытым концам вектора. Затем эти фрагменты могут соединяться ковалентно в растворе, содержащем фермент ДНК-лигазу. Итогом всей процедуры являются бактериальные плазмиды. каждая из которых содержит одиночный фрагмент ДНК человека. Их называют рекомбинантными плазмидами или просто рекомбинантной ДНК (Cohen et al.. 1973; Blattner et al.. 1978).

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

Рис. 10.1. Опыт по гибридизации нуклеиновых кислот, из которого становится ясно, что ядрышко кодирует рибосомную 28S-PHK. Из содержащих 2, 1 и 0 ядрышек клеток головастиков экстрагировали по отдельности ДНК. Полученную ДНК денатурировали (делали одноцепочечной) и определенное количество одноцепочечной ДНК запекали на нитроцеллюлозных фильтрах. Одновременно из клеток взрослых лягушек получали радиоактивную 28S-pPHK путем выделения рибосом и последующего разделения трех основных видов РНК. Радиоактивную 28S-pPHK инкубировали на ДНК-содержащих фильтрах в условиях, когда она могла присоединяться к комплементарным участкам ДНК. Затем измеряли радиоактивность фильтров в сцинтилляционном счетчике.

Рис. 10.2. Метод получения комплементарной ДНК (кДНК). Б о льшая часть информационных РНК (мРНК) содержит протяженную последовательность из остатков аденозина (АААn) на 3’-концс молекул (см. гл. 11): поэтому, экспериментаторы гибридизуют «затравку», состоящую из 15 остатков дезокситимидина (дТ15), с 3'-концом мРНК. Затем с помощью обратной транскриптазы синтезируют комплементарную цепь ДНК, начиная от затравки дТ15., кДНК можно выделить с помощью повышения pH раствора, что вызывает денатурацию двухцепочечного гибрида и деградацию РНК.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ 83

Таблица 10.1. Широко используемые рестриктазы
Фермент	Источник	Сайт узнавания и расщепления1

¹ Все сайты узнавания рестриктаз имеют центральную симметрию. Двухцепочечная последовательность, прочитанная в одном направлении, идентична последовательности, прочитанной в обратном направлении.

На рис. 10.3 показана плазмида pBR322, которая часто используется молекулярными биологами в качестве клонирующего вектора. Она несет два гена устойчивости к антибиотикам – tc ^R, который обеспечивает устойчивость к тетрациклину, и Ар^R, который делает бактерии устойчивыми к ампициллину. Эти гены устойчивости к антибиотикам, столь нежелательные для медиков, становятся незаменимыми для генных инженеров, поскольку один из Bam H1 сайтов в этой плазмиде расположен в середине гена tc ^R. Предполагаемые рекомбинантные плазмиды. полученные описанным ранее способом, затем инкубируют с клетками Ε. coli дикого типа, чувствительными к обоим антибиотикам, в условиях, позволяющих бактериям захватить эти плазмиды. При этом не каждая бактерия включает плазмиду и не каждая плазмида включает чужеродный ген. т.к. липкие концы плазмиды в сайте рестрикции могут ренатурировать друг с другом. Для отбора тех бактерий, которые включили плазмиды, обработанные клетки Ε. coli выращивают на агаре в присутствии ампициллина. При этом выживают только те бактерии, которые включили плазмиды. Затем часть каждой жизнеспособной колонии переносится на агар, содержащий тетрациклин. Если бактерии продолжают рост, то, следовательно, ген tc ^Rплазмиды остался интактным и эта плазмида восстановилась в результате простого соединения собственных концов друг с другом. Если бактерии, выросшие на среде с ампициллином, не выживают на среде с тетрациклином, то ген устойчивости к тетрациклину в плазмиде уже не функционирует. Это означает, что ген tc ^R разорван фрагментом фермента рестрикции из чужого генома. Со среды, содержащей ампициллин, отбираются те колонии, которые не росли на среде, содержащей тетрациклин. Эти колонии следует проверить на присутствие определенного гена.

Клетки из каждой колонии E. coli, содержащей рекомбинантные плазмиды, помещают на нитроцеллюлозный фильтр. После лизиса клеток клеточная ДНК присоединяется к фильтру. Затем цепи ДНК разделяют с помощью нагревания и инкубируют фильтр в растворе, содержащем радиоактивную РНК (или ее кДНК-копию) для гена, выбранного для клонирования. Если плазмида содержит этот ген, то ДНК этого гена должна присутствовать на бумаге и только эта ДНК обладает способностью присоединять радиоактивную РНК или кДНК. Именно поэтому соответствующие места фильтра окажутся радиоактивными. Радиоактивность этих участков регистрируется с помощью радиоавтографии. Для этого чувствительная рентгеновская пленка помещается поверх обработанной бумаги. Электроны с высокой энергией, излучаемые радиоактивной РНК, сенсибилизируют зерна серебра в пленке, вызывая их потемнение при последующем проявлении. В результате над каждой колонией, содержащей рекомбинантную плазмиду с определенным геном, образуется темное пятно (рис. 10.3). Эти колонии изолируют и выращивают вновь. В итоге можно получить многие триллионы клеток, каждая из которых содержит сотни рекомбинантных плазмид.

Рекомбинантные плазмиды можно отделить от хромосомы Ε. coli с помощью центрифугирования. Фрагмент ДНК человека, содержащий интересующий нас ген, высвобождается при инкубации плазмид с Bam H1. Этот фрагмент затем отделяют от плазмидной ДНК. Таким образом, экспериментатор получает микрограммы очищенной ДНК, содержащей определенный ген. [Хотя описанная процедура выглядит вполне логичной и простой, число колоний, которые следует скринировать, достигает часто астрономических чисел. Число случайных фрагментов, которые должны быть клонированы, для того чтобы получить интересующий вас ген, возрастает с увеличением сложности генома организма¹. Чтобы клонировать с 99%-ной надежностью желаемый ген из Е. coli, необходимо проанализировать примерно 1500 колоний. Для млекопитающих это число возрастет до 800 000: вместо

¹ Сложность в данном случае определяется числом генов различного типа, содержащихся в клеточном ядре.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

84________________ ГЛАВА 10 __________________________________________________________

Рис. 10.3. Стандартная схема клонирования ДНК. В качестве примера используется введение последовательности ДНК человека в плазмиду с одним Bam H1-чувствительным сайтом.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ 85

того чтобы выращивать бактерии в стандартных чашках Петри, колонии зачастую выращивают на подносах из кафетериев (Blattner et al., 1978; Slightom et al., 1980).]

При альтернативном методе клонирования в качестве исходного материала используется цитоплазматическая РНК, а не геномная ДНК. Как показано на рис. 10.2. можно получить цепи ДНК, комплементарные цепям мРНК. На следующем этапе процедуры одноцепочечную ДНК с помощью ДНК-полимеразы можно перевести в двухцепочечную. Полученные цепи ДНК после присоединения к ним подходящих «концов» могут быть встроены в плазмиды. Пришивка фрагментов ГАТЦЦ/Г к срезанным концам фрагмента ДНК создает искусственный рестрикционный Bam H1-сайт и позволяет фрагменту ДНК самостоятельно встроиться в плазмиду, разрезанную ферментом.

Такие коллекции клонов, полученных из мРНК. называют обычно библиотеками. Можно, например, получить библиотеку для печени мыши, которая будет содержать гены, участвующие в синтезе белков печени. Можно также получить библиотеку для вегетативного полушария ооцита Xenopus, которая будет представлять мРНК, содержащуюся только в этой части клетки. Полученные подобным образом гены представляют значительный интерес, поскольку они не содержат интронов. После добавления к бактериальным клеткам эти гены могут транскрибироваться и затем транслироваться в кодируемые ими белки.

Дополнительные сведения и гипотезы: Когда ген клонирован...

... предстоит еще проделать большую работу. В последующих главах будет наглядно показано, что клонированные гены революционизировали наши представления о развитии. Некоторые методы использования рекомбинантных ДНК описаны ниже.