Сайт-специфичный мутагенез и трансляция разрыва

Одно из наиболее продуктивных приложений методик с использованием рекомбинантных ДНК связано с возможностью изменить конкретный нуклеотид в клонированном гене и затем выяснить, влияет ли это изменение на функционирование гена. Специфическое мутирование осуществляется с помощью олигонуклеотид-направленного сайт-специфичного мутагенеза. Для этого сначала определяют последовательность ДНК и искусственно синтезируют олигонуклеотид. который имеет правильную последовательность, за исключением одной (или нескольких) замен. Затем этот олигонуклеотид длиной от 12 до 15 пар оснований смешивают с одноцепочечной рекомбинантной плазмидой, содержащей последовательности кДНК к гену дикого типа. Олигонуклеотид будет гибридизоваться с плазмидой, несмотря на то что одна из его пар оснований некомплементарна. Модифицированный олигонуклеотид можно затем использовать в качестве затравки для репликации оставшейся части плазмиды и клонированной ДНК с помощью ДНК-полимеразы 1 Е. coli. Далее концы отреплицированных плазмид связываются ковалентно с помощью ДНКлигазы и плазмиды вводятся в клетки Е. coli. Половина реплицирующихся плазмид восстанавливает

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ _________________ 91

Рис. 10.13. Олигонуклеотид-направленный сайт-специфический мутагенез. Олигонуклеотид с одним замененным основанием гибридизуется с комплементарной цепью клонированной ДНК. Остальная часть цепи может быть синтезирована ДНК-полимеразой I E. coli, использующей олигонуклеотид в качестве затравки. Кольцо замыкается ковалентно с помощью лигазы. После введения плазмиды в клетки E. coli молекула реплицирует ген дикого типа и мутантный ген. (По Watson et al., 1983.)

Рис. 10.14. Ник-трансляция. Одноцепочечный разрыв (ник) вводится в двухцепочечную ДНК с помощью ДНКазы I. В ходе репарации разрыва ДНК-полимеразной I Е. coli этот фермент удаляет основания впереди себя. Если в среде присутствуют радиоактивные нуклеозидтрифосфаты, то они могут быть использованы для репарации образующихся брешей. В результате получается цепь ДНК с высокой удельной радиоактивностью. (По International Biotechnologies. Inc. Catalogue, 1985.)

последовательность дикого типа, тогда как в половине плазмид возникает мутация с заменой одного основания (рис. 10.13). (Применив дополнительные генетические приемы, можно получить мутантных клонов больше, чем клонов дикого типа.) Мутантные клоны и клоны дикого типа различаются по эффективности гибридизации с точными копиями исследуемого участка (Gillam et al., 1980; Smith, 1985). Мутантный ген может быть изолирован из этих плазмид и транслирован в мутантный белок. Остается выяснить, функционирует ли этот белок, несмотря на замену определенной аминокислоты.

При трансляции разрыва (ник-трансляции) также используют ДНК-полимеразу, но несколько иным образом. С помощью этого метода одну из цепей в клонированном гене можно заместить радиоактивными нуклеотидами, создавая таким образом высокорадиоактивные образцы для Саузерн-блотов, Нозерн-блотов и гибридизации in situ. Клонированный ген изолируют из плазмиды и обрабатывают ДНКазой I в низкой концентрации. Этот фермент надрезает ДНК в случайных местах, образуя свободные 3'-гидроксильные концы, к которым может присоединяться ДНК-полимераза I. Одна из особенностей ДНК-полимеразы I Е. coli заключается в том, что она добавляет нуклеотиды на одном конце, одновременно удаляя нуклеотиды впереди разрыва (рис. 10.14). В результате происходит «движение» разрыва («трансляция ника») вдоль цепи ДНК (Kelly et al., 1970; Rigby et al., 1977). После замены исходных оснований на радиоактивные удельная радиоактивность фрагментов ДНК может превышать 10⁸ имп/мин на 1 мкг ДНК.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

92________________ ГЛАВА 10 ________________________________________________________________________