Перенос генов

Во многих случаях желательно получить ген, модифицировать его и затем вернуть в эукариотический организм. Это осуществляется с помощью трансфекции - метода, посредством которого фрагменты ДНК можно ввести в хромосомную ДНК клетки. Клонированную ДНК смешивают с селективным маркерным геном (таким, как ген тимидинкиназы вируса Herpes simplex) и высокополимерной ДНК из какого-либо другого организма. Эту смесь инкубируют с фосфатом кальция: при этом образуются ДНК-содержащие кристаллы, которые фагоцитируются клетками в культуре.

В случае дефицитных по тимидинкиназе клеток можно вырастить культуру в условиях, обеспечивающих выживание лишь тех клеток, которые захватили кристаллы ДНК–фосфат кальция (и потому экспрессируют ген тимидинкиназы) (Perucho et al., 1980; Robins et al., 1981). На рис. 10.7 показан опыт, в котором глобиновые гены человека смешивали с геном тимидинкиназы вируса Herpes и большими фрагментами ДНК хомячка. Селекция колоний на

1

Рис. 10.7. Трансфекция ДНК глобинового гена из генома одного вида в геном другого вида. Клонированные глобиновые гены человека, маркерный ген (ген тимидинкиназы), позволяющий проводить селекцию, и протяженные фрагменты ДНК из генома другого вида соосаждаются в виде кристаллов в фосфате кальция. Кристаллы, содержащие ДНК, захватываются клетками, и при соответствующих внутриклеточных условиях ДНК интегрируется в хромосомы клеток-хозяев. (По Watson et al., 1983.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

88________________ ГЛАВА 10 ______________________________________________________________________________

присутствие тимидинкиназы выявила наличие в хромосоме мыши многочисленных глобиновых генов человека, чередующихся с ДНК хомячка (Watson et al., 1983). Недавно аналогичный метод был использован для переноса генов в стволовые клетки эмбриональной карциномы мыши. Эти стволовые клетки можно интегрировать в зародышей мыши, где из них впоследствии образуется часть тканей взрослой мыши (гл. 6). При последующем спаривании таких мышей новые гены могут попадать в каждую клетку их потомства (Gossler et al., 1986).

Эффективность метода переноса с фосфатом кальция довольно низка, поэтому были разработаны другие методы. Один из них состоит в микроинъекции ДНК непосредственно в ядро (или пронуклеус) клетки (Capecchi, 1980; рис. 10.8). При хорошем навыке и специальном оборудовании можно инъецировать около 1000 клеток за час (в удачный день); при этом до 50% инъецированной ДНК интегрируется в хромосомы клеток. Этот метод был использован для введения генов ß -цепи глобина человека в зиготы мыши, дефицитные по ß -цепям. Развившиеся из этих зигот мыши имели функционирующие гены ß -цепи глобина человека, компенсировавшие генетическое заболевание (Constantini et al., 1986).

Относительно новым методом является использование ретровирусных векторов. Ретровирусы это РНК-содержащие опухолеродные вирусы. Внутри клетки-хозяина они синтезируют свою ДНК-копию (используя собственную обратную транскриптазу): затем копия переводится в двухцепочечную форму и интегрируется в хромосому хозяина. Эта интеграция осуществляется благодаря присутствию двух идентичных последовательностей (длинных конце-

Рис. 10.8. Инъекция ДНК в ядро (в данном случае в пронуклеус яйцеклетки мыши). (И) Wagner et al.. 1981: фотография с любезного разрешения T. F. Wagner.)

вых повторов) на концах ДНК. Ретровирусные векторы получены при помощи удаления генов, обеспечивающих упаковку вируса, из центральной части ретровируса мыши. Благодаря такому удалению создается свободный участок, куда можно поместить другие гены. Гены, которые были клонированы в плазмидах, могут быть выделены из них (с помощью подходящей рестриктазы) и встроены в ретровирусные векторы. Часть этого участка может быть занята селективным маркером (таким, как тимидинкиназа вируса Herpes simplex). Такие ретровирусные векторы инфицируют клетки мыши с эффективностью, достигающей 100%. Мышь со стабильными генами, полученными от других организмов (с помощью микроинъекции, вирусной инфекции или включения модифицированных стволовых клеток эмбриональной карциномы), называют трансгенной мышью.