Главная страница Случайная страница КАТЕГОРИИ: АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника |
ДНК- и РНК-блоттинг
ДНК-блоттинг (называемый также Саузерн-блоттингом или гибридизацией по Саузерну) представляет собой метод для выявления определенного гена (Sauthern, 1975) с последующим изучением его функций. С помощью ретровирусного вектора ген фактора, стимулирующего образование колоний гранулоцитов и макрофагов (КСФ-г, м). Вводили в клетки, которые в обычных условиях не синтезируют этот фактор, но чувствительны к нему (Lang et al., 1985). Некоторые из клеток, обработанных рекомбинантным вирусом, начинали неконтролируемый рост, образуя после пересадки в мышь злокачественные опухоли. Получили ли все эти клетки дополнительные копии гена КСФ-г, м? Транскрибируют ли эти дополнительные гены мРНК для КСФ-г, м? На первый из этих вопросов ответ был получен с помощью ДНК-блоттинга. Ланг и его коллеги выделяли ДНК из клеток полученных злокачественных колоний и обрабатывали ее рестриктазой. Затем фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в геле. Помещая гель с фрагментами ДНК в раствор щелочи, добивались денатурации ДНК до отдельных цепей. После нейтрализации гель переносили на влажную фильтровальную бумагу на подложке из пластика (рис. 10.9). Нитроцеллюлозный фильтр (способный связывать одноцепочечную ДНК) помещали прямо на гель и накрывали его несколькими слоями бумажных полотенец. Края фильтровальной бумаги, лежащей под гелем, были опущены в сосуд с буфером высокой ионной силы. Буфер поднимался через гель и далее через нитроцеллюлозный фильтр и полотенца. При этом ДНК задерживалась на нитроцеллюлозном фильтре). После запекания ДНК на фильтре (иначе произойдет ее утечка) фрагменты
Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с. ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ 89
ДНК инкубировали с радиоактивной кДНК к соответствующему гену (можно использовать также и мРНК). Радиоавтограф нитроцеллюлозного фильтра показал, где радиоактивная ДНК нашла себе комплементарную ДНК. В итоге Лaнг с коллегами показали (рис. 10.10), что помимо двух обычных генов мыши, продуцирующих КСФ-г, м и расположенных в рестрикционном фрагменте длиной 7800 пар оснований, злокачественные клетки имеют ген КСФ-г, м, полученный от вируса (о чем свидетельствует наличие последовательностей вирусной ДНК) и лежащий в рестрикционном фрагменте длиной 5500 пар оснований. Для каждого из клонов злокачественных клеток был получен аналогичный результат. Экспрессию этих генов можно продемонстрировать с помощью РНК-блота (обычно называемого Нозерн-блотом). В отличие от Саузерн-блота, при котором из геля на бумагу переносят ДНК, при Нозерн-блоте (название не связано с фамилией исследователя) аналогичным образом из геля на бумагу переносят РНК. Нозерн-блоты весьма полезны при изучении накопления специфических мРНК в цитоплазме определенной клетки. В данном случае цитоплазматическую РНК изолируют из злокачественных клеток, инфицированных ретровирусом, содержащим ген КСФ-г, м, и из незлокачественных клеток, инфицированных аналогичным ретровирусом, но лишенным гена КСФ-г, м. РНК из каждого клеточного клона фракционировали в геле и переносили на нитроцеллюлозный фильтр. После инкубации фильтра с кДНК к гену КСФ-г, м было обнаружено, что во всех злокачественных клонах транскрибируется ген КСФ-г, м. Другие клетки его не транскрибируют (рис. 10.11). Ланг с соавторами пришли к выводу, что в клетках транскрибируется искусственно выделенный ген КСФ-г, м, находящийся под контролем вируса. Далее оказалось, что эти клетки, которым требуется КСФ-г, м для роста, приобрели способность синтезировать свой собст-
Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с. 90 ГЛАВА 10
венный КСФ-г, м. Таким образом, они стимулируют себя к непрерывному делению, образуя в конечном счете опухоли. [Это наблюдение подтверждало гипотезу Тодаро и др. (Todaro et al., 1977), которые предсказали подобный феномен в 1977 г. Эти опыты по индукции опухолей будут подробно рассматриваться в гл. 20.] Одним из важных применений Нозерн-блота является определение времени начала экспрессии какого-либо конкретного гена. Исследователь может выделить препараты РНК из зародышей на различных стадиях развития и разделить их с помощью электрофореза на параллельных дорожках геля. После переноса расфракционированной РНК на нитроцеллюлозный фильтр методом блоттинга фильтр со связанной РНК инкубируют в растворе, содержащем радиоактивный одноцепочечный фрагмент ДНК исследуемого гена. Эта ДНК будет связываться только с теми участками, где находится комплементарная РНК. Таким образом, если мРНК для данного гена присутствует на определенной стадии эмбриогенеза, то радиоактивная ДНК должна связываться с ней и ее можно зарегистрировать с помощью радиоавтографии. Радиоавтографы этого типа называют Нозерн-блотами развития. На рис. 10.12 показан Нозерн-блот развития для экспрессии гена алкогольдегидрогеназы у Drosophila. Можно видеть, что мРНК для этого белка синтезируется на всех стадиях зародышевого развития, кроме стадии куколки, и у взрослой особи (Savakis, Ashburner, 1985).
|