РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ (RNAi)

РНК-интерференция – специфическая деградация определенных мРНК или не способность транслироваться. Молекул мРНК совпадают по последовательностям с молекулами двухцепочечной РНК (дцРНК).

Явление РНК-интерференции рассматривают как систему защиты клеток от РНК-содержащих вирусов и мобильных генетических элементов (транспозонов) и обеспечивающую эффективную регуляцию работы генов в процессе онтогенеза. Некодирующих РНК обнаружено много, и они выполняют в клетке множество различных функций.

В 1998 году в журнале «Nature» результаты своих экспериментов опубликовали Э.Файер и К.Мэллоу. Инъекция молекул двухцепочечной РНК (РНК в виде двух спаренных комплементарных цепей) в организм нематоды приводила к эффективному и строго специфичному выключению (подавлению экспрессии) гена. После выключения гена перестает образовываться кодируемый им белок и, следовательно, исчезает определенный признак; при этом другие гены организма продолжают работать. Поскольку в данном случае происходит «наложение» гомологичных по нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот, Э. Файер и К. Мэллоу назвали это явление РНК-интерференцией (RNA interference, RNAi).

Позже это явление найдено у всех организмов.

Механизм. 1) В клетке присутствуют молекулы двуцепочечной РНК. Появляются они в связи с процессом транскрипции сонаправленных промоторов, активности клеточной или вирусной РНК-зависимой РНК полимеразы, появлением самокомплементарных транскриптов, которые способны отжигаться сами на себя с образованием шпилечных структур.

Источник двуцепочечной РНК – искусственно введенные в клетку молекулы РНК.

2) Белок Dicer режет дцРНК на короткие фрагменты (около 21-23 нуклеотидов; образуются короткие двуцепочечные интерферирующие РНК (siRNA), а также белки. Далее короткие РНК становятся частью другого рибонуклеинового комплекса RISC. Основным белковым компонентом комплекса является белок Argonaute (AGO). В процессе образования активированного комплекса РНК-дуплекс расплетается. Одна из цепей остается в составе комплекса и направляет поиск комплементарных последовательностей в других комплексах. Молекулы, несущие комплементарные нуклеотидные последовательности, распознаются комплексом и подвергаются специфической деградации. Белки Аrgonaute, входящие в состав комплекса RISC, осуществляют расщепление РНК-мишеней, которое происходит посередине области комплементарности, узнаваемой молекулой siRNA.

мРНК комплекс последовательности либо расщепляют, либо подавляют трансляцию.

В геноме есть специализированные системы управления работой генов. У животных, таких как млекопитающие, насекомые и круглые черви, известны две системы, основанные на двух классах малых регуляторных РНК – миРНК (Micro RNA) и пиРНК (Piwi-interacting RNA).

Малые регуляторные РНК изначально закодированы в геноме организма-хозяина. Гены миРНК найдены в геноме двустороннесимметричных животных, высших растений и некоторы хводорослей. Гены кодируют не сами миРНК, а более крупные молукулы – предшественники. Считанная с такого гена длинная молекула РНК сворачивается в двойную спираль за счет присутствия палиндромных последовательностей нуклеотидов, связанных друг с другом по принципу комплементарности. В ядре первичные миРНК-транскрипты (при-миРНК) разрезаются РНКазо-III-подобным белком Drosha до пре-миРНК длиной 65 нуклеотидов, затем транспортируются белком Exportin 5 в цитоплазму, где разрезаются белком Dicer на РНК-дуплексы длиной 21–23 нуклеотида, которые затем присоединяются к белку семейства Argonaute, обеспечивая подавление генной экспрессии.

Белки семейства Piwi есть и у млекопитающих (они называются MIWI и MILI); они тоже синтезируются во время сперматогенеза и образуют комплексы с пиРНК.

У мышей включаются гены, к-рые обеспечивают синтез пиРНК и пиви-белков. Молекулы пиРНК (24-29 пар нуклеотидов гомологичны тем или иным участкам МГЭ; пиРНК и пиви-белки распознает РНК с МГЭ, в результате подавляется активность МГЭ.

Последовательности пиРНК мышей имеют гомологию не только с МГЭ, но и совпадают с последовательностями «рабочих» генов либо с фрагментами генома, функции которых неизвестны. Отключение генов, детерминирующих синтез Piwi-белков (MILI-мутанты), приводит к резкому росту активности (экспрессии) мобильных генетических элементов.

Набор пиРНК, производимых сперматоцитами, меняется с возрастом, причем весьма резко. Существуют два разных «набора» пиРНК. Один из них, «ранний», обнаруживается в семенниках мышат примерно до 12–14-дневного возраста. После этого начинают образовываться совсем другие, «поздние», пиРНК.

пиРНК могут влиять на активность МГЭ не только путем интерференции, но и другим способом – через механизм метилирования ДНК, которое осуществляется специальными ферментами – ДНК-метилтрансферазами. На растениях было показано, что определенную роль в этом могут играть маленькие молекулы РНК, которые каким-то образом «указывают» ДНК-метилтрансферазам гены, подлежащие метилированию. У насекомых, в отличие от млекопитающих, метилирование ДНК для регуляции работы генома (и МГЭ в частности) почти не используется. И у мух, и у мышей в работе системы «Piwi – пиРНК» используется принцип обратной связи: чем активнее МГЭ, тем больше производится в клетке соответствующих пиРНК и тем эффективнее осуществляется подавление активности этих МГЭ.

Гетерохроматин (неактивный хроматин) – LINE, SINE и LAP => метилирование ДНК-метилазой + РНК-интерференция => суперскручивание и образование центров распространения.

Описанные процессы влияют на ход онтогенеза (первые стадии и до дробления)

Из книги. Оба класса миРНК и пиРНК молекул, характерные для высших животных, имеются и у самых примитивных представителей животного царства, а именно у актинии Nematostella и губки Amphimedon.

В геноме актинии удалось обнаружить гены 40 различных миРНК, причем только одна из этих регуляторных молекул оказалась сходной с известными миРНК высших животных. Молекулы-предшественники миРНК у актинии оказались довольно короткими. У губки нашли восемь генов миРНК, непохожих ни на миРНК высших животных, ни на миРНК актинии. Одна из молекул-предшественников является предшественником не одной, а сразу двух миРНК, причем одна из них работает преимущественно в клетках личинки, а другая – в клетках взрослой губки. В геноме губки были обнаружены гены, детерминирующие синтез белков Drosha и Pasha, которые подготавливают молекулу-предшественницу к обработке белками Dicer.

У актинии и губки обнаружено также много разнообразных пиРНК.

Каждая пиРНК инактивирует мобильные элементы со строго определенной последовательностью нуклеотидов.