Метилирование ДНК

Проблема индивидуального развития является центральной проблемой. В процессе онтогенеза меняется активность генов, т.е одни гены не активны, а другие уже активируются на ранних стадиях онтогенеза – дифференцировка генов и геномный импринтинг. Обратимые изменения активности генов, не связанные с нарушением нуклеотидной последовательности ДНК, но приводящие к сохранению неактивного или активного состояния генов в ряду поколений, называются эпигенетическими ( метилирование, геномный импринтинг, РНК-интерференция, прионизация ).

Метилирование – временная химическая модификация нуклеотидной последовательности ДНК без нарушения её кодирующей способности. Метилированию подвергаются Ц и А, при этом не нарушается комплементарность. Происходит с участием S-аденозилметионина (SAM) (донор метильной группы), может происходить “спонтанно” без участия ферментов. В результате дезаминирования метилированного цитозина возникает тимин, что часто происходит в клетке и приводит к мутации, закрепляемой при репликации ДНК

• Наиболее эффективно “спонтанно” метилируется цитозин в мотиве CpG

• То же самое происходит в геномах in vivo, результат – элиминация мотивов CpG (у растений – CpNpG) (у позвоночных утеряно 75%).

Метилирование Ц в последовательности CpG осуществляется более эффективное; у растений – CpNpG островки. Если метилирование CpG => области становятся не активными в плане экспрессии. У эукариот – М. ключевой этап в онтогенезе, дифференцировке клеток, подавлении экспрессии чужих агентов или последовательностей и МГЭ в. Метилирование в основном происходит пострепликативно, наименьшая суммарная активность метилаз - в G1 фазе клеточного цикла, увеличивается к S-фазе и опять падает в G2/М

• Статус метилирования ДНК эукариот обратим, существует равновесие между метилированием и деметилированием

• Деметилирование может быть активным (катализируется ферментами) и пассивным (отсутствие метилирования в очередном цикле репликации)

Большинство актов метилирования in vivo как у прокариот, так и у эукариот происходит с участием ДНК-метилтрансфераз (DNMT).

В клетках млекопитающих действуют, по крайней мере, две системы метилирования, за которые отвечают разные метилазы

Метилирование de novo вносит элементы изменчивости в профиль метилирования

Поддерживающее метилирование обеспечивает поддержание уже сформированного профиля (уровень точности> 99%)

Виды метилирования и деметилирования

ü Пассивное или активное деметилирование

ü “Учреждающее” метилирование (РНК-зависимое)

ü Активное деметилирование

ü Метилирование de novo

ü Поддерживающее метилирование

ДНК-метилтрансферазы высших позвоночных

– метилируют Ц и А остатки в строго определенных последовательностях.

Dnmt1: поддерживающая метилаза локализуется в фокусах репликации, в 3’направлении, способна проявлять активность метилазы de novo. У мышей может наблюдаться не нормальное развитие; около 10 консервативных функциональных доменов, явл-еся местами связывания с белками клеточного цикла.

Dnmt2: РНК-метилаза, метилирует в основном некоторые транспортные РНК.

Dnmt3a: de novo метилаза

• но: in vitro одинаковая активность на полуметилированной и неметилированной ДНК – возможна поддерживающая активность

• мутанты: постнатальная летальность

Dnmt3b: de novo метилаза

• одинаковая активность на полуметилированной и неметилированной ДНК, предпочитает мини- и микросателлиты

• необходима для метилирования центромерных минисателлитных повторов Нарушение синтеза Dnmt3b – редкий ICF syndrome (Immunodeficiency, Centromeric instability, Facial anomalies).

Dnmt3l

• гомологичен другим DNMT-белкам, но не имеет собственной каталитической активности

• поддерживает de novo метилазы Dnmt3a и Dnmt3b, способствуя связыванию этих ферментов с ДНК и стимулируя их активность

• ассоциирует с Dnmt3a и Dnmt3b, участвует в установлении импринтов во время гаметогенеза и репрессии транскрипции импринтированных генов

• у мутантов – мужская стерильность, экспрессия обоих аллелей импринтированных генов в гаметах

В геномах млекопитающих последовательности CрG представлены неравномерно: обнаруживаются участки, где такие последовательности сгруппированы, образуя так называемые CрG-островки. Эти островки занимают около одной тысячи нуклеотидных пар ДНК. Островки чаще встречаются в районах промоторов генов позвоночных, распространяясь в область начала гена.

Эффекты метилирования CpG на регуляцию экспресии проявляются на уровне транскрипции. Метилирование ДНК ингибирует экспрессию генов с помощью двух (относительно) независимых механизмов

Прямое влияние метилирования ДНК на транскрипцию – препятствие связыванию факторов транскрипции

Метилирование подавляет связывание с ДНК ряда ТФ (таких, как NF-kB, MLTF, СREB, с-Мус, АP-2, EF2)

Пример: AP-2 активирует транскрипцию гена проэнкефалина человека

Для некоторых ТФ, например, АР-1, метилирование, напротив, создает новые сайты связывания

К метилированной ДНК присоединяются белки, распознающие метилированные основания благодаря наличию в них особых метил-СрО-связывающихся доменов. (MBD – methylated DNA binding domains, связывающие белки). Известно несколько видов таких белков – МеСР1, МеСР2, MBD1, MBD2, MBD3, CTCF, BORIS, Kaiso.

Результат дефицита MeCP-2 - синдром Ретта: X-сцепленное нейродегеративное заболевание, смерть в 15-30 лет частота встречаемости 1: 10, 000-15, 000 (только женщины) причина – мутация в гене, кодирующем MeCP-2, результат - утрата генного сайленсинга многими локусами.

Метилирование связано с повторяющимися последовательностями или элементами. Некоторые классы повторяющихся элементов, существующих даже временно в качестве дифференциально метилированных районов, могут оказывать эпигенетическое влияние на соседние и отдаленные последовательности и гены. Некоторые неэкспрессирующиеся гены содержат дифференциально метилированные тандемные повторы и ретровирусподобные последовательности. Кандидатами на М. становятся SINE и LINE повторы: во-первых, имеют транспозон- и ретропозонподобной природой, во-вторых, возможна функция метилирования в качестве системы защиты от разного рода «паразитических» элементов и, в-третьих, обнаружена обогащенность LINE-элементами X-хромосомы млекопитающих, которая, как известно, подвергается инактивации в соматических клетках.

Явление парамутации: окраска кукурузы – в гетерозиготе Аа они не окрашены и наблюдается влияние и А, и а малого; может метилироваться транспозон, к-рый может находиться между А большим и а малым.

При усложнении генома от низших к высшим метилирование изменялось.

Может возникать компенсаторный механизм, при к-ром гены у самки экспрессируются как у самца.