Лекция 9

Прионизация - это процесс преобразования конформационной структуры белковых молекул соответственно определенной матрице, в роли которой выступает прион. Ряд нейродегенеративных заболеваний (губчатых энцефалопатий) человека и других млекопитающих связан с белковой инфекцией. К числу таких болезней относятся: куру, семейная бессонница, болезнь Герштмана – Штресслера – Шайнкера, болезнь Кройцфельда – Якоба у людей, а также бычья губчатая энцефалопатия («коровье бешенство»), скрепи у овец, коз, оленей, мышей, хомяков и других животных.

За открытие и изучение прионов – инфекционных белков, переносящих эти заболевания, – С. Прусинеру вручили в 1997 г. Нобелевскую премию.

Прионизация подразумевает копирование белков, т.е их конформации, а не их аминокислотный состав, и, по сути, является матричным процессом. При этом процессе белок-прион перестраивает по своему подобию конформацию вновь синтезированных гомологичных полипептидов. В отличие от линейных матриц ДНК или РНК (матрицы первого рода) в процессе прионизации используются матрицы пространственные, или конформационные (матрицы второго рода). Матрицы первого рода лежат в основе воспроизведения, а также реализации генетической информации. Матрицы второго рода преимущественно работают на уровне реализации генетической информации, точнее – после трансляции. Открытие процесса прионизации, по сути, дополняет центральную догму молекулярной биологии, которая может быть представлена в несколько ином виде.

ДНК

РНК белок

Белок

В основе прионизации лежат многие процессы. Этот частный феномен характерен не только для млекопитающих, у которых он обнаружен впервые, но и для низших эукариот – грибов. Наиболее подробно он исследован у дрожжей – 1965 г, Кокс описал наличие фактора белковой природы (пси-фактор), наследуемый через цитоплазму. Удобным свойством дрожжевых прионов является возможность их элиминации из клетки при выращивании дрожжей на 5 мМ хлориде гуанидина (ГГХ).

Прионы грибов подобно прионам млекопитающих представляют собой конформационные варианты обычных клеточных белков. Они могут спонтанно претерпевать конформационные перестройки (обогащение β -слоями), после чего приобретают ряд новых свойств, прежде всего способность к агрегации за счет взаимодействия β -слоев и образование так называемых амилоидов (своего рода процесс биологической кристаллизации с переходом в нерастворимую форму), становятся кислото- и протеазоустойчивыми.

При этом частично или полностью теряется собственная функциональная активность прионизующихся белков. Клетка или организм становится дефектным по функции белка-предшественника приона.

Наиболее разработанной моделью прионизации является модель - структурный ген sup35 (прион [PSI]) у дрожжей S. cerevisiae. Цитоплазматический наследственный фактор [PSI], проявляющийся как нонсенс-супрессор, а также супрессор некоторых сдвигов считывания, является прионной изоформой белка-фактора терминации трансляции eRF3 – продукта гена sup35. Появление такого аномального белка может быть обусловлено определенными мутационными изменениями в пределах гена sup35 и в результате увеличения его экспрессии без нарушений последовательности гена.

Обнаружен был фактор следующим образом: на среде с аденином (ade 1-14) были выращены мутанты, несущие нонсенс-мутацию. В середине находился стоп-кодон UGA=> синтезировался усеченный нефункциональный белок Ade1. При наличии пси фактора кодон считывался как значащий (без аденина дрожжи расли).

Обнаружен ген-супрессор sup35. Мутации в гене приводят к считыванию стоп-кодона. На плазмиду вносили ген sup35 не мутантный=> считывание стоп-кодонов, превращение в Psi-фактор.

Плазмиду(20-30 копий) вносили в клетку Leu^- . В малокопийную плазмиду вшивали центромерную последовательность, отвечающую за малокопийность, + вносили индуцирующий промотор галактозы. В результате клетки имели Psi фактор.

Наблюдаемая супрессия является результатом усиленной экспрессии белка sup35, а не его амплификация.

Цитоплазматический наследственный фактор [PSI], проявляющийся как нонсенс-супрессор, а также супрессор некоторых сдвигов считывания, является прионной изоформой белка-фактора терминации трансляции eRF3 – продукта гена sup35. Появление такого аномального белка может быть обусловлено определенными мутационными изменениями в пределах гена sup35 и в результате увеличения его экспрессии без нарушений последовательности гена (показано, что прион [PSI] появляется в клетках при введении гена sup35 с чужеродным промотором, обеспечивающим высокий уровень его экспрессии).

Белки приобретаю новые свойства, и превращаются в цитоплазматические факторы. Цитогены дрожжей сходны с прионами позвоночных.

Белковые тяжи (прионы) найдены были в нервной ткани в большом количестве. Прионная форма белков обеспечивает повышенную их устойчивость к протеолизу, а также другую конформационную укладку.

За открытие явления прионизации Гайдучек в 1976 году получил Нобелевскую премию. В результате исследования куру и других упомянутых заболеваний человека и животных силами многих ученых была достоверно доказана белковая природа инфекционного агента во всех случаях.

Были обнаружены случаи наследственной предрасположенности к прионным заболеваниям, был обнаружен ядерный ген Prp у человека, а также у животных, мутации в котором тоже являются причиной этих заболеваний. Ген Prp выделен из нескольких организмов, сравнение последовательности нуклеотидов этих генов показало, что все они похожи друг на друга, то есть гомологичны. Особенно много общего у них в начальной части - кодирующей N-терминальный конец полипептида. Первопричиной болезни является спонтанное изменение характера укладки полипептидной цепи - изменение третичной структуры белка. В результате этого белок инактивируется, образуя конгломераты, устойчивые к протеолизу. Это и есть прионная форма белка.

N-терминальный конец полипептида обеспечивает возможность прионизации. Для терминального конца полипептида характерны повторы: 7-9 аминокислотных остатков повторяются 4-6 раз; чаще всего это октопептид, обогощенный глицином. Участки, обогащенные повторами, образую бэта-слои, а не альфа-спирали. Если удалить часть, отвечающую за синтез последовательности, аномалий не наблюдается.

Нормальный PrP - PrPС - является мембранным белком, экспрессирующимся независимо от прионной инфекции. В инфекционном материале обнаружена альтернативная форма этого белка - PrPSc (от английского scrapie) идентичного размера, при обработке протеиназой К он превращается в белок с молекулярной массой 27-30 кДа (Prusiner et al., 1982), в котором отсутствовуют 66 N-концевых аминокислот. Кроме того, PrPSc отличается от PrPC плохой растворимостью в детергентах и склонностью к агрегации (Prusiner et al., 1983; Oesch et al., 1985).

В 1982 году Стэнли Прузинер сформулировал прионную концепцию, состоящую в том, что прионная форма белка PrPSc является патогенным агентом и стимулирует конформационный переход нормальной формы PrPC (С, cellular) в PrPSc (Sc, scrapie), что и определяет его инфекционность.

Изменения генов приводят к повышению восприимчивости инфекций.

Прионизацию следует рассматривать как многостадийный процесс. Стадии:

- инициации,

- роста,

- размножения прионных агрегатов.

Последний этап обусловлен отщеплением от крупных агрегатов олигомеров меньшего размера – так называемых семян. Последние попадают в дочерние клетки и служат затравкой для роста новых агрегатов. Так происходит размножение приона. В этом процессе ведущая роль принадлежит шаперонам, прежде всего Hsp104.

Проанализировав аминокислотную структуру известных прионизующих пептидов, Дж. Вейсман и М. Мичелич составили список белков дрожжей, обогащенных в N-участке повторами аспарагина и глутамина. Такие белки являются потенциальными прионами. У дрожжей в этот список попало 107 белков, что составляет около 2 % всех их белков, а у дрозофилы 472 белка, что составляет около 3, 5 % всех ее белков.

Для некоторых белков из «списка Вейcмана» показано, что их прионизующий пептид, присоединенный к eRF3 вместо собственного N-домена, обеспечивает его прионизацию. Локус является ключевым. Количество прионов не основывается на списке белков.

Прионизация отдельного белка – это не одиночное событие, а, скорее всего, отражение существования некоторых прионных сетей, пронизывающих клетку. На это указывает зависимость появления одних прионов от наличия других. Так, прион [PSI] не может появиться в клетке, если в ней нет другого приона [PIN]. [PIN] – продукт структурного гена rnq1, функция которого пока не известна.

Прионные сети, или каскад прионизации, – это отражение реальной системы протеома в клетке, когда изменения одного белка сказываются на структуре и функциях других белков. Следовательно, прионизация – это взаимодействие не только гомологичных, но и гетерологичных полипептидов. Точно так же можно показать, что существует не только взаимосвязь прионизация –прионизация, как в случае прионных сетей, но и мутация – прионизация.

В результате некоторых мутаций гена sup35 появляются прионоподобные факторы ([ISP], [ASP]) – антисупрессоры.

Прионизация – перестройка белков и его компонентов, и считается нормальным клеточным процессом.

Известен ряд клеточных процессов и структур, связанных с перестройкой белков или их комплексов. Среди них динамика цитоскелета – сборка и разборка микротрубочек, сборка и разборка ядерной оболочки в каждом митотическом делении высших эукариот. Последнее время цитологи все чаще обращаются к рассмотрению клеточного ядра как своеобразного ансамбля самособирающихся и разбирающихся микрокомпартментов, создающих своего рода хромосомные территории и эпигенетически регулирующих репликацию и транскрипцию. К числу таких процессов относится и образование спайдерина – нитей паутины паукообразных. Это все процессы своеобразной биологической кристаллизации, очень напоминающие прионизацию.

Значение прионизации для эволюции.

Во-первых, прионизация может влиять на ход матричных процессов. Возникновение нонсенс-супрессии и супрессии некоторых мутаций типа «сдвига рамки считывания», т. е. частота ошибок трансляции увеличивается. Изменениям подвергаются и другие фундаментальные процессы (репликация, репарация, структура хроматина), если белки, принимающие в них участие, будут подвергаться прионизации. Исходя из этих соображений, можно предположить, что модификационная и наследственная изменчивости могут быть взаимообусловлены и связаны неслучайным образом.

Во-вторых, прионизация – это белок-белковые взаимодействия.

В-третьих - нарушениее баланса в протеоме, т.е прионизация или мутации, безусловно, требуют периода балансировки системы, ее стабилизации. Если мутации в генах приводят к синтезу аномального белка (приона), последующий процесс прионизации может приводить к модификациям, которые, в свою очередь, будут обеспечивать возникновение мутационных изменений. Например, если первичное событие – модификационная перестройка ядерной оболочки в каком-то ее компартменте, то следствием этого события может быть нарушение взаимодействия оболочки с хромосомами, что потребует компенсаторных генетических событий.