Лекция 6

Цитобионты

Среди факультативных (необязательных) элементов цитоплазмы особый интерес представляют цитобионты. пример, вирус сигма, который присутствует в цитоплазме соматических и половых клеток дрозофилы. Это РНК-содержащий пулевидный ретровирус. Вирус присутствует в соматических и половых клетках (было описано в 1937 году). Некоторые линии мух чувствительны к CO₂ (умирают). Этот признак чувствительности наследуется через цитоплазму не только по материнской линии, но и через самцов.

Чувствительность к СО₂ оказывается связна с размножением вируса. Оогонии содержат 10 -40 вирусных частиц, тогда как ооциты порядка 10 млн. Вирус сигма –факультативный элемент. Внешнея воздействия могут инактивировать вирус(высокая температура блокирует репликацию вируса). Если самок и самцов выдерживать несколько дней про 30 С^о, их потомство будет свободно от вируса и устойчиво к СО_2.

Показано, что вирус может быстро меняться. В результате чего мухи устойчивы к СО₂ , и они будут устойчивы к повторному заражению вирусом. Вирусы могут наследоваться в ряду покалений.

Вольбахия

Бактерия вольбахия впервые была обнаружена в яичниках комара обыкновенного (Culex pipiens) в 1924 г. Однако всерьез изучать ее стали лишь много десятилетий спустя, когда выяснилось, что именно она является причиной множества разнообразных патологий развития и размножения животных. Вольбахией заражены многие насекомые (по последним данным, не менее 20 % видов), а именно: мухи (в том числе, излюбленный объект генетиков – дрозофила), комары, бабочки, жуки, блохи, прямокрылые (кузнечики, саранчовые, сверчки), перепончатокрылые (муравьи, осы и др.), ногохвостки и многие другие. Кроме насекомых, вольбахия найдена у пауков, клещей, мокриц (наземных равноногих ракообразных), нематод (круглых червей). Далеко не все группы беспозвоночных досконально проверены, и по мере изучения круг известных хозяев вольбахии постоянно растет. Но уже сейчас ясно, что зараженность вольбахией у наземных беспозвоночных – явление повсеместное и массовое. Например, из общего числа видов муравьев, обитающих в Индонезии, вольбахией заражено 50 %, из всех наземных изопод (мокриц) – 35 %, из нематод-филярий – 90 %.

Вольбахия может жить только внутри клеток живого организма (ее нельзя вырастить на искусственных средах и даже в культурах ткани разводить ее удается с большим трудом). Передается вольбахия «вертикально», т. е. по материнской линии, проникая в цитоплазму яйцеклеток, заражая потомство. Горизонтальная передача, безусловно, тоже происходит, но очень редко. Она сильно затруднена тем, что вольбахия абсолютно не способна жить вне клеток живого организма.

Разные штаммы вольбахии неодинаково взаимодействуют со своими хозяевами, радикально изменяя их размножение, развитие и даже ход эволюции. Эффект, оказываемый вольбахией на хозяина, определяется в первую очередь специфичностью штаммов вольбахии, т. е. разновидностью самой бактерии (которых известно несколько сотен), а также биологическими особенностями хозяина. Среди эффектов, оказываемых вольбахией на организм хозяина, можно выделить тследующие.

Цитоплазматическая несовместимость – наиболее распространенный (и, по-видимому, эволюционно самый древний, первичный) эффект вольбахии. Проявляется он в том, что когда зараженный самец оплодотворяет незараженную самку, эмбрионы оказываются нежизнеспособны-

ми и гибнут на ранних стадиях развития. Происходит это потому, что мужские хромосомы в оплодотворенном яйце разрушаются и оно остается гаплоидным. Установлено, что вольбахии, живущие в самце, каким-то образом изменяют («метят») хромосомы сперматозоидов. Эта «метка» и является причиной разрушения хромосом после оплодотворения. Однако, если самка заражена тем же самым штаммом вольбахии, мужские хромосомы не разрушаются, и из яйца развивается нормальная особь (естественно, зараженная). По-видимому, присутствующие в яйцеклетке бактерии «распознают» метку и «спасают» хромосомы от разрушения.

З биохимических модели, объясняющие как идет мечение и спасение:

1) Ключ-замок. Замок образует бактерия, находящаяся у самца. Отцовские хромосомы получаются после оплодотворения закрыты на замок. В инфицированных вольбахией яйцах есть бактер. ключ, который открывает замок, происходит восстановление отцовских хромосом и они будут готовы к расхождению.

2) Титрование-восстановление. Были получены моноклональные антитела к вольбахии. В инфицированных яйцах антитела связаны с вольбахией, но не связаны с хромосомой хозяина. Если клетка не инфицирована происходит сигнал связывания антитела с конденсированными хромосомами. Вольбахия способны вытеснять гистоны, которые обеспечивают суперскрученность.Такое вытеснение происходит в инфицированных яйцах перед оплодотворением. После оплодотвореняи вольбахия вытесняет гистоны(«спасение»). У вольбахии есть генетические системы, которые могут снимать (титровать) гистоны хромосомы.

3) Модель задерживающего движения. В зиготах при несовместимых скрещиваниях отцовские хромосомы могут конденсированься с образование анафазоподобных структур, появление этих структур блокирует вступление в митоз. Вольбахия обеспечивает образование некого комплекса, который связывается с хромосомами отца и замедляет их движениево время митоза. Замедление движения приводит к ассинхронности поведения отцовских и материнских хромосом. Если яйца содержат вольбахия, то она может модифицировать материнскую хромосому синхронно во время первого митоза.

Партеногенез. В некоторых случаях вольбахии удается заставить своих хозяев (а именно: ос, клещей, трипсов и ногохвосток) размножаться партеногенетически (без оплодотворения). При этом у перепончатокрылых в норме из неоплодотворенных (гаплоидных) яиц развиваются самцы, из оплодотворенных – самки. Таким образом, насекомые имеют возможность регулировать пол потомства, оплодотворяя или не оплодотворяя свои яйцеклетки. Вольбахия вмешивается в этот процесс, нарушая нормальный ход развития насекомого. Когда неоплодотворенное гаплоидное яйцо (из которого должен развиться самец) начинает делиться, вольбахия останавливает процесс митоза, когда хромосомы уже удвоились, а дочерние клетки еще не разделились. В результате в клетке оказывается двойной набор хромосом, и из нее развивается самка. Некоторые популяции ос, зараженные вольбахией, полностью утратили способность к нормальному половому размножению и не возвращаются к нему, даже если их вылечить от вольбахии антибиотиком. В таких популяциях самцы отсутствуют. Кроме вольбахии, партеногенез у ос иногда вызывают и другие цитоплазматические бактерии.

Феминизация. У мокриц (наземных равноногих ракообразных) и бабочек вольбахии научились превращать генетических самцов в самок, воздействуя на систему выработки андрогенного гормона. При отсутствии этого гормона из эмбриона развивается самка, при его на личии – самец. У зародышей мокриц мужского пола вольбахия подавляет развитие андрогенной железы, вырабатывающей данный гормон. Если заразить вольбахией более взрослого самца мокрицы, у которого уже имеется андрогенная железа, все равно происходит частичная феминиза-

ция, хотя деятельность андрогенной железы при этом продолжается. При частичной феминизации появляются интерсексы – особи с различными сочетаниями мужских и женских признаков. В этом случае, вероятно, вольбахия подавляет способность тканей адекватно реагировать на андрогенный гормон. Из этого видно, что воздействие вольбахии на хозяина может иметь комплексный характер; разные механизмы воздействия могут дублировать и «подстраховывать» друг друга. Интересно, что у обеих групп, где наблюдается индуцированная вольбахией феминизация (изопод и бабочек), самки гетерогаметны (имеют две разные половые хромосомы WZ), а самцы гомогаметны (имеют две одинаковые половые хромосомы ZZ). Если вылечить «самку» (т. е. зараженного генетического самца с хромосомами ZZ), тогда молодая «самка» частично или полностью превращается в самца, а старая остается самкой, но производит на свет исключительно одних самцов так как у нее нет «женской» W-хромосомы. Кроме вольбахии, феминизацию различных видов беспозвоночных могут вызывать некоторые другие бактерии, а также простейшие (микроспоридии и парамиксидии).

Гибель самцов (андроцид). Иногда вольбахия является причиной гибели эмбрионов мужского пола (у божьей коровки, двух близких видов африканских бабочек, одного вида дрозофил). Гибель самцов вызывается целым рядом других бактерий (риккетсиями, эрлихиями, спироплазмами), а также паразитическими простейшими. Для вольбахии это скорее исключение. Любопытно, что, по крайней мере, в некоторых случаях эффект гибели самцов вызывается вольбахией у тех видов насекомых (в частности, у божьих коровок), в популяциях которых присутствуют и другие виды бактерий – «самцеубийцы» (male-killers). Высказано предположение, что иногда частичная гибель самцов выгодна самим насекомым, поэтому данный эффект генетически закреплен со стороны хозяина. Возможно, насекомые реагируют гибелью самцов на определенные факторы внешней среды, общие для вольбахии и других «самцеубийц». Важно отметить, что среди немногочисленных насекомых, у которых вольбахия вызывает андроцид, есть виды как с гетерогаметными самками (бабочки), так и самцами (дрозофила, божьи коровки). Следовательно, «распознавание» самцов происходит не по набору половых хромосом, а как-то иначе.

Повышение плодовитости и жизнеспособности. У водной осы единственный эффект, вызываемый вольбахией, состоит в резком увеличении плодовитости самок. У других мух и ос этот эффект сочетается с цитоплазматической несовместимостью. Иногда вольбахия повышает плодовитость самцов. У некоторых насекомых (например, дрозофилы) после излечения от вольбахии отмечается снижение плодовитости, продолжительности жизни и других параметров общей приспособленности. Следует отметить, что в ряде случаев эти эффекты исчезают через не- сколько поколений (жизнеспособность и плодовитость вновь становятся такими же высокими, как у зараженных особей). Это наводит на мысль о том, что «польза», приносимая вольбахией хозяину, – иллюзорная (по крайней мере, в некоторых случаях). Может быть, вольбахия иногда вызывает нечто вроде наркотической зависимости или пользуется известным приемом «яд – противоядие», распространенным у некоторых паразитов. Например, паразит может вырабатывать длительно действующий яд и не длительно действующее противоядие. В результате гибель паразита незамедлительно ведет к смерти хозяина. Хозяин сам заинтересован в том, чтобы любой ценой сохранить своего паразита. Для нематод-филярий вольбахия является жизненно необходимым

симбионтом. «Вылеченные» от вольбахии нематоды погибают. На этом основана новая методика лечения филяриоза. Самих нематод «заморить» гораздо труднее, чем их симбионтов – вольбахий, которые быстро погибают от обычного тетрациклина. Разнообразные эффекты вольбахии, судя по всему, возникали в эволюции различных ее штаммов многократно и независимо. Например, штаммы, вызывающие феминизацию у бабочек и мокриц, не родственны между собой. Это говорит о том, что, вероятно, все эти эффекты базируются на какой-то единой молекулярно-генетической основе и могут сравнительно легко переходить один в другой.

Геном вольбахии небольшой по размеру (у штамма wMel – 1 267 782 пары нуклеотидов, 1322 открытые рамки считывания), что в целом характерно для бактерий, являющихся облигатными внутриклеточными паразитами. При этом в ее геноме обнаружено большое количество МГЭ, в том числе три профага (у некоторых штаммов вольбахии обнаружены активные фаги), а также повторяющиеся последовательности. Это уникальная особенность вольбахии отличает ее от известных внутриклеточных паразитов. С одной стороны, для нее характерно упрощение генетической организации, с другой – рекордно большое количество МГЭ, которые в ходе упрощения генома должны элиминироваться одними из первых, как вовсе не обязательные для выживания бактерии в ее достаточно стабильной среде обитания – цитоплазме клеток хозяина.

По сравнению с другими (в том числе близкими) видами у вольбахии выявляется большое число дуплицированных генов, среди которых не только МГЭ, но гены, детерминирующие синтез белков (например, дуплицирован участвующий в репарации ген mutL).

Предполагается, что мобильные генетические элементы попали в геном вольбахии из внешнего источника (возможно, с помощью бактериофагов) после разделения линий вольбахии и риккетсии, но до расхождения штаммов вольбахии (которое произошло примерно 100 млн лет назад). Этот вывод основан на том, что у риккетсии соответствующие МГЭ отсутствуют, а у разных штаммов вольбахии они сходны между собой. Предполагается, что большое число МГЭ в упрощенном геноме вольбахии связано с необходимостью реагировать на изменения, возникающие в ее среде обитания. Например, у дрозофил стрессовые факторы вызывают активизацию их собственных МГЭ, приводящую к мутационным взрывам. В природных популяциях Drosophila melanogaster (хозяев штамма wMel) отмечены вспышки мутагенеза, причем многие из этих мутаций во время вспышек очень неравномерно распространены между полами (у самок частота мутации бывает в несколько раз выше, чем у самцов). Это свидетельствует о возможной связи возникающих мутаций с передающимися по материнской линии внутриклеточными бактериями. Наличие такой связи пока не установлено, однако показано, что обмен генетическим материалом между вольбахией и ее хозяином происходит. В пользу горизонтального переноса между паразитом и хозяином свидетельствуют данные, полученные при анализе геномов насекомых и круглых червей-филярий, у которых обнаружены фрагменты генома вольбахии, причем в одном случае – у Drosophila ananassae – геном бактерии оказался вставлен в геном хозяина целиком.

Изобилие активных мобильных элементов обеспечивает вольбахии ее необычайную эволюционную пластичность, поскольку позволяет быстро изменять свой генетический аппарат в ответ на изменения, происходящие в геноме хозяев либо связанные со сменой хозяина.

Анализ генома вольбахии показал, что для взаимодействия с хозяином решающую роль играют следующие генетические детерминаты.

Гены wsp, детерминирующие поверхностные антигены (Wolbachia surface protein).

Гены, детерминирующие белки секреторной системы IV типа ( type IV secretion system – T 4 SS), обеспечивающего выведение белковых продуктов из бактерии в цитоплазму хозяина.

Гены, детерминирующие белки с анкириновыми повторами (ankyrin repeats), являющиеся по своему строению типичными эукариотическимирегуляторными белками. В клетках эукариот белки с анкириновыми повторами участвуют в регуляции многих важных процессов, в том числеуправляют работой цитоскелета.

Установлено, что гены wsp детерминируют белки, локализованные на наружной поверхности вольбахии. В геноме присутствуют три паралогичных варианта гена wsp (собственно wsp, wsp B и wsp C), причем они довольно сильно отличаются друг от друга (сходство wsp B с wsp – 19, 7 %, wsp C с wsp – 23, 5 %). Оказалось, что последовательности этих детерминант сильно варьируют у разных штаммов и являются штаммоспецифичными. Эту особенность используют для классификации разновидностей вольбахии (определенная нуклеотидная последовательность гена wsp является главным маркерным признаком в классификации вольбахий).

Известно, что поверхностные белки (антигены) бактерий часто играют ключевую роль во взаимоотношениях с хозяином. Было показано, что белки Wsp определяют цитоплазматическую несовместимость, в результате которой происходит деградация хромосом самца. Именно данные белки определяют специфическую локализацию вольбахий в ооцитах и эмбрионах дрозофилы, обеспечивают перемещение вольбахий внутри клеток хозяина и их взаимодействие с цитоскелетом. Вольбахии в яйце связаны с тубулиновыми микротрубочками и локализованы у полюсов митотических веретен.

Гены wsp вольбахии сходны с генами, детерминирующими белки, регулирующими транспорт различных веществ (например, липопротеинов) из бактериальной клетки во внешнюю среду. Кроме того, обнаружена гомология Wsp - белков с некоторыми бактериальными белками- агглютининами, участвующими в реакциях специфического связывания.

Вольбахия обладает сложной системой выведения различных веществ из бактериальной клетки в цитоплазму клеток хозяина. Эта система сходна с аппаратом бактериальной конъюгации (функционирует за счет секреторной системы IV типа), обеспечивающим обмен генетическим материалом между родственными бактериями.

Конъюгационный аппарат бактерий представлен тремя основными компонентами: проводящим каналом, расположенным в толще клеточной стенки; АТФ-азами, обеспечивающими весь аппарат необходимой энергией; половыми пилями, при помощи которых конъюгирующие

бактерии вступают друг с другом в плотный контакт. Многие патогенные бактерии используют данный аппарат для введения определенных веществ в клетки хозяина. Интересно отметить, что белки секреторной системы IV типа у вольбахии имеют гомологию не только с белками аппарата конъюгации, но и с белковыми молекулами, способными связываться с хромосомами и регулирующими митоз в клетках эукариот. Данный факт весьма интересен, поскольку вольбахия воздействует напротекание процесса митоза клеток хозяина. В состав одного из T4SS-опе-ронов вольбахии входит белок WspB. Это явно указывает на тесную связь между секреторной системой IV типа и Wsp-белками. Связь может быть как структурной, так и функциональной.

Анкириновые белки, характерные для вольбахии, довольно редко встречаются у бактерий. Считается, что это типично эукариотические регуляторные белки, обеспечивающие разнообразные межбелковые взаимодействия. Особенно важную роль они играют в регуляции работы

цитоскелета. Геном вольбахии содержит большое количество белков с анкириновыми повторами (у вольбахии штамма wMel таких белков 23). Установлено, что некоторые из этих белков выводятся наружу через секреторную систему IV типа. Кроме того, эти белки могут регулировать клеточный цикл хозяина и/или взаимодействовать с его цитоскелетом.

Некоторые из анкириновых белков вольбахии проявляют сходство с различными регуляторными белками эукариот (включая D. melanogaster), способными связываться с важнейшими компонентами эукариотического цитоскелета – актином, миозином, кортактином. Есть

сходство и с анкириновыми белками, регулирующими процесс апоптоза (программируемой клеточной смерти).

О том, что вольбахия способна взаимодействовать с цитоскелетом и влиять на его функционирование, говорят многие факты. Это ассоциированность вольбахий с микротрубочками и полюсами митотических веретен в яйце и эмбрионе у насекомых; вызываемые вольбахией

нарушения митоза, в том числе изменения в движениях хромосом, в поведении отцовской центриоли в оплодотворенном яйце и т. д. По- видимому, белки с анкириновыми повторами играют ключевую роль во взаимоотношениях вольбахии с организмом хозяина. Большое число анкириновых белков, имеющихся у этой бактерии, возможно, обеспечивает разнообразие эффектов, оказываемых вольбахией на хозяев.