Метод НВЧ - определение количества колиформных бактерий. При определении количества колиформных бактерий по методу НВЧ высевают не менее трех последовательных навесок продукта и (или) его разведений

При определении количества колиформных бактерий по методу НВЧ высевают не менее трех последовательных навесок продукта и (или) его разведений, отличающиеся по количеству продукта в них в 10 раз.

9.2.1 Навеска, исходная суспензия и разведения

Отбор навесок, приготовление исходного разведения и десятикратных разведений проводят по ГОСТ 26669.

Готовят достаточное число разведений по ГОСТ 26669, гарантируя, что все пробирки, соответствующие конечному разведению, покажут отрицательный результат.

9.2.2 Инокуляция и инкубация

9.2.2.1 Используют три пробирки для каждой навески продукта и(или) его разведения.

9.2.2.2 Стерильной пипеткой переносят в каждую из трех пробирок с одной из селективных обогатительных сред двойной концентрации [см. таблицы 1а, 2а, 3а] 10 см пробы, если она жидкая, или 10 см исходной суспензии при использовании других продуктов.

Каждую навеску продукта в трехкратной повторности высевают в среду двойной концентрации в пробирки размером 20х200 мм.

Соотношение между количеством высеваемого продукта и питательной средой двойной концентрации 1: 1.

9.2.2.3 Другой стерильной пипеткой переносят в каждую из трех пробирок с одной из селективных обогатительных сред нормальной концентрации [см. таблицы 1б, 2б, 3б] 1 см пробы, если продукт жидкий, или 1 см исходной суспензии при использовании других продуктов.

Каждую навеску продукта и (или) его разведения в трехкратной повторности высевают в пробирки размером 16х160 мм.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой 1: 10.

9.2.2.4 Каждое последующее разведение высевают в соответствии с 9.2.2.3, используя новую стерильную пипетку. Осторожно перемешивают инокулум и среду.

9.2.2.5 Пробирки с посевами в среду двойной концентрации (см. 9.2.2.2) инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.

9.2.2.6 Пробирки с посевами в среду нормальной концентрации (см. 9.2.2.3 и 9.2.2.4) инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч. Если нет образования газа и/или помутнения, препятствующего выявлению образования газа, продолжают инкубирование еще (24±2) ч.

9.2.3 Подтверждение

9.2.3.1 Из каждой пробирки после инкубации по 9.2.2.5 инокулируют петлей подтверждающую среду (6.1б-6.4б). Посевы инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч. Если нет образования газа и/или помутнения, то продолжают инкубирование еще (24±2) ч.

В качестве арбитражной среды используют бриллиантовый зеленый лактозный желчный бульон.

9.2.3.2 Повторяют процедуру, описанную в 9.2.3.1 для пробирок после инкубации по 9.2.2.6, показавших образование газа и/или помутнение после (24±2) ч или после (48±2) ч.

Допускается не проводить пересев на жидкую подтверждающую среду при явном газообразовании на жидких средах нормальной концентрации, считая при этом эти посевы положительными.

9.2.4 Оценка результатов

Возможные случаи оценки результатов приведены в приложении А.

Для каждой навески продукта и/или его разведения подсчитывают число пробирок, в которых обнаружено образование газа (положительные пробирки) после (24±2) ч и (если использовали) после (48±2) ч.

9.2.5 Подсчет и выражение результатов

Подсчитывают наиболее вероятное число, исходя из числа положительных пробирок в каждой навеске продукта и/или его разведении. По ГОСТ 26670 определяют НВЧ колиформных бактерий в 1 г или 1 см продукта.

9.3 Метод определения количества колиформных бактерий - подсчет колоний

9.3.1 Навеска и исходное разведение

Отбор навесок и приготовление исходного разведения - по ГОСТ 26669.

9.3.2 Инокуляция и инкубация

9.3.2.1 Для посева жидкого продукта и/или каждого разведения используют две параллельные чашки Петри. Переносят стерильной пипеткой 1 см жидкого продукта или соответствующего разведения в центр каждой чашки. При посеве жидкого продукта и/или каждого разведения в чашку Петри используют отдельную стерильную пипетку.

9.3.2.2 В каждую чашку Петри (9.3.2.1) наливают около 15 см одной из сред (6.5-6.7) температурой 44 °С - 47 °С. Время, прошедшее между посевом продукта и/или его разведения в чашку Петри и заливкой среды, не должно превышать 15 мин.

Аккуратно перемешивают инокулят со средой и оставляют смесь для застывания, для этого чашки Петри помещают на холодную горизонтальную поверхность.

В качестве арбитражной среды используют VRBL-агар.

Параллельно для контроля стерильности агаризованной среды в стерильную чашку Петри наливают приблизительно 15 см среды и инкубируют вместе с посевами.

9.3.2.3 После застывания среды в чашках Петри на ее поверхность наливают около 4 см использованной агаризованной среды (6.5-6.7) температурой 44 °С - 47 °С для создания второго слоя. Добавленная среда должна затвердеть, как описано в 9.3.2.2.

9.3.2.4 При определении колиформных бактерий посевом на агаризованные селективно-диагностические среды (6.5-6.7) по 0, 1 или 0, 2 см навески продукта или его разведения наносят на поверхность одной из этих сред, разлитых в две параллельные чашки Петри. Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посев проводят по ГОСТ 26670.

При применении метода мембранных фильтров по ГОСТ 26670 фильтры переносят на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, избегая образования пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

При посеве методом мембранных фильтров на них подсчитывают количество колоний и в том случае, если их менее 15.

9.3.2.5 Переворачивают крышкой вниз приготовленные чашки по 9.3.2.3 и 9.3.2.4 и инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.

9.3.3 Подсчет количества колоний

После инкубации по 9.3.2.5 отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний. Посевы просматривают и отмечают рост типичных и атипичных колоний.

На VRBL-arape типичные колонии колиформных бактерий пурпурно-красные диаметром не менее 0, 5 мм, иногда окружены красноватой зоной преципитата (осадка) желчи.

На агаре с бриллиантовым зеленым и феноловым красным типичные колонии колиформных бактерий зеленоватые, окруженные яркой желто-зеленой зоной.

На среде Эндо типичные колонии колиформных бактерий от розового до красного цвета, часто с металлическим блеском.

Атипичные колонии отличаются от типичных по цвету и размеру. К атипичным относят также все типичные колонии, выросшие в результате ферментации сахаров, за исключением лактозы, содержащихся в пищевых продуктах. Такие колонии не будут принадлежать к колиформным бактериям.

Подсчитывают на агаризованных средах отдельно количество типичных и атипичных колоний.

9.3.4 Подтверждение принадлежности бактерий из колоний к колиформным бактериям

Отбирают не менее чем по пять атипичных и типичных колоний. Каждую отобранную колонию пересевают в пробирки с одной из жидких питательных сред, приготовленной по 6.1-6.4.

В качестве арбитражной среды используют лактозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью.

Рост с газообразованием при температуре (37±1) °С в течение 24 ч указывает на принадлежность бактерий из атипичных и типичных колоний к колиформным.

9.3.5 Подсчет и выражение результатов

Если при подтверждении типичных или атипичных колоний в 80% случаев, то есть не менее чем в четырех из пяти колоний, подтвержден рост колиформных бактерий, то считают, что все колонии, выросшие на чашке Петри (см. 9.3.3), принадлежат к колиформным бактериям. В остальных случаях количество колиформных бактерий определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству колоний, взятых для подтверждения.

Пересчет количества колиформных бактерий, определенного посевом в или на агаризованные среды, на 1 г (см ) продукта проводят по ГОСТ 26670.

Результаты определения количества колиформных бактерий и выявления их в определенной навеске продукта записывают по ГОСТ 26670.

9.3.6 Допускается также выявление колиформных бактерий проводить посевом в или на агаризованную среду при условии, что навеску продукта, в которой предусматривается выявление, возможно посеять по этому методу.

При выявлении колиформных бактерий посевом в или на агаризованную среду подсчета количества колоний не проводят.