Главная страница Случайная страница
КАТЕГОРИИ:
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника
Классификация дезинтегрирующих воздействий по их природе
|
|
| Физические | Химические | Энзиматичес-кие | Биологичекие | |
| Механические | Немеханические | |||
| Баллистические, экструзионные, ультразвуковые, газодекомпрес-сорные, гидроударные, электрогидро-ударные, комбинированные. | Осмотический, замораживание, дегидратация, медленная газовая декомпрессия, фазовые переходы при высоких давлениях. | Действие щелочей, кислот, солей, детергентов, хелатных агентов, органических растворителей | Действие бакте-риологических, дрожжелитических, микроли-тических ферментов | Действие фагов, бактериоцинов, плазмидоподо-бных факторов, ингибирование синтеза клеточ-ной оболочки, автолиз. |
II. Экстракция белков. Когда достигнуто тонкое измельчение материала, переходят к следующему этапу – извлечению белков. Выбирая различные экстрагенты и подбирая режимы экстракции (время, температура и т.п.) можно избирательно перевести в раствор разные группы белков.
Так, например, проводя экстракцию водой, мы переводим в раствор альбумины.
Глобулины – солерастворимые белки, экстрагируются растворами солей, например, 5-10% NaCl.
Проламины – спирторастворимые белки, экстрагируются 60-80% этанолом, а глютелины – разбавленным раствором щелочей (0, 1-0, 2%).
Извлечению белков способствует обработка детергентами: додецилсульфатом натрия, дезоксихолатом натрия, тритоном х-100, алкилгликозидами и др.
СН3–(СН2)10–СН2–О– 
–ОNа
Додецилсульфат натрия
|
 |
|
/ COONa
Дезоксихолат натрия
Н3С –С 
– СН2 –С 
– – (О–СН2–СН2–)10 –ОН
Тритон х-100
CH2OH
H O
O-(CH2)7-CH3
 | |
OH H
H OH
Октил-β, Д-глюкопираноза
Детергенты ослабляют гидрофобные белково-липидные и белок - белковые взаимодействия, способствуют разрыву этих связей.
III. Осаждение белков. После экстракции смеси белков проводят их осаждение. Фракционирование белков проводят с помощью:
1) трихлоруксусной кислоты;
2) осаждение органическими растворителями (спиртом, ацетоном и др.);
3) высаливание белков;
4) осаждение в изоэлектрической точке, путем изменения рН белкового экстракта;
a. осаждение путем тепловой коагуляции и др.
IV. Очистка белков. Для очистки белков, их фракционирования широко используют хроматографические методы: адсорбционная, ионообменная, хроматография по сродству (аффинная хроматография), метод гель-фильтрации (метод молекулярных сит), методы изоэлектрического фокусирования, электрофоретическое разделение белков и др.
Широкое распространение получил метод гель-фильтрации. В качестве геля используют препараты сефадексов различных марок, которые отличаются между собой величиной ячеек в гранулах.
Через колонку, заполненную набухшим сефадексом, пропускают исследуемый белковый экстракт. Белки, молекулы которых по своим размерам превосходят размеры ячеек в гранулах сефадекса, проходят между частицами геля и выходят из колонки раньше низкомолекулярных белков, которые задерживаются внутри гранул сефадекса. Происходит разделение белков по молекулярной массе.
Электрофоретическое разделение белков основано на том, что белки, имеющие разные по величине и знаку заряды в электрическом поле постоянного тока, будут двигаться к катоду или аноду. Скорость движения определяется величиной заряда.
Классификация методов связана с типом электролитической системы, типом носителя, конструкцией аппаратуры, а также способом обнаружения разделяемых белковых фракций.
Широкое распространение получил электрофорез в полиакриламидном геле.
Метод изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) основан на разделении белков, имеющих разные изоэлектрические точки. ИЭФ осуществляется в процессе их электрофоретического разделения на колонке, по высоте которой создается градиент рН. Белок движется под воздействием электрического поля, пока не достигнет той области колонки, где рН равен изоэлектрической точке данного белка. Суммарный электрический заряд белка становится равным нулю; белок теряет подвижность и концентрируется в этой области в виде узкой зоны. Молекулы различных белков будут образовывать зоны в той или иной части колонки в соответствии со значениями их изоэлектрических точек. ИЭФ позволяет разделять белки, различающиеся значениями изоэлектрических точек на 0, 02 единицы.
Применяются и другие разновидности электрического разделения: иммуноэлектрофорез, изотахофорез, метод пептидных карт и ультрацентрифугирование.
Для установления первичной структуры белка (последовательности расположения аминокислотных остатков в одной или нескольких полипептидных цепях) проводят ряд сложных операций (схема 2).
Определение последовательности аминокислотных остатков в индивидуальных пептидах проводят фенилизотиоцианатным методом Эдмана, масс-спектрометрическим, ферментативным, генетическим, методом лазерной фотодиссоциации, обладающего высокой чувствительностью (для анализа достаточно 5 нмоль белка при молекулярной массе 50 кДа).
В методе масс-спектрометрии фрагментацию осуществляют воздействием электронного удара, а разделение фрагментов – в масс-спектрометре. В результате получают масс-спектр фрагментов пептида (рис.2).
Схема 2