Источник рентгеновских лучей

пучок рентгеновских лучей

кристалл белка

фотопленка

Рис.3. Схема рентгеновского кристаллографического анализа. Однонаправленный рентгеновский поток падает на белковый кристалл, который вызывает дифракцию лучей.

Определение структуры миоглобина и гемоглобина обеспечило первые представления о природе трехмерной структуры глобулярных белков.

В отличие от рентгеноструктурной кристаллографии, ядерно-магнитная резонансная (ЯМР) спектроскопия позволяет изучать белки в растворах и, следовательно, не требует трудоемкого получения кристаллов белков. ЯМР спектроскопия основана на абсорбции электромагнитного излучения молекул в магнитных полях, позволяет определять состояние спинов определенных атомных ядер. При изучении белковой структуры обычно определяют спины водородных атомов.

Рентгеноструктурная кристаллография и ЯМР спектроскопия требуют больших количеств очищенного белка.

Метод дисперсии оптического вращения (ДОВ) является также одним из важнейших методов изучения белков в их водных растворах. Он основан на способности белков вращать плоскость поляризации света, падающего на их образцы. Измерение угла вращения проводят на спектрополяриметре. Однако метод ограничен в результате гидрофобных взаимодействий и ван-дерваальсовых сил.

Для исследования белков используются также УФ-спектрофотометрия. Метод основан на гипохромном эффекте, т.е. понижении поглощения света при длине волны 190 нм белком, имеющим α -спирали и β -структуры по сравнению с белком с разрушенными этими структурами.

Используют также метод электронной микроскопии, который в совокупности с вышеуказанными методами могут дать исчерпывающую информацию о структуре белка.

При анализе аминокислотного состава пищевых белков проводят полный гидролиз исследуемого экстракта белков или пептидов и определение суммарного (аминного азота) содержания аминокислот или всех аминокислот в гидролизате. Для гидролиза обычно используют 5-7 N-раствор НCl, а при анализе содержания триптофана, неустойчивого в кислой среде, раствор щелочи.

Благодаря наличию карбоксильных и аминных групп аминокислоты проявляют свои специфические реакции, которые нашли применение при разделении, идентификации и количественном определении аминокислот. Реакции по карбоксильным группам аминокислот протекают аналогично превращениям карбоновых кислот, т.е. образуют соли, сложные эфиры, тиоэфиры, с формальдегидом дают метильные или метиленовые производные.

Сложные эфиры разных аминокислот со спиртами имеют различные коэффициенты летучести.

R₁ – – СООН + НОR₂ = R₁ – – + Н₂О

Поэтому их легко можно разделить фракционной перегонкой в вакууме.

В специфических реакциях аминокислот особую роль играет реакционная способность α -аминогруппы. Реакция с азотистой кислотой (реакция Ван-лайка) позволяет определить суммарное содержание аминокислот по выделившемуся газообразному азоту.

R – СН – СООН + НNО₂ = R – СН – СOOH + N₂ + Н₂О

гидроксикислота

α -аминогруппа может вступать в реакцию с формальдегидом (реакция Зёренсона):

R – – СООН + 2О = = R -СН – СООH

При этом аминогруппа блокируется гидроксиметиленовой группой и теряет свои основные свойства, сохраняя кислотные свойства аминокислоты, которую затем можно оттитровать раствором щелочи. Эта реакция нашла применение при количественном определении по методу формольного титрования аминокислот:

R – СН – СООН + NaОН → R – СН – СООNa + Н₂О

N N

НОН₂С СН₂ОН НОН₂С СН₂ОН

Для идентификации и количественного анализа аминокислот широкое применение получила цветная реакция с нингидрином:

При рН 5, 5 и нагревании с избытком нингидрина аминокислота дегидрируется, декарбоксилируется с образованием СО₂, NН₃, альдегида, а нингидрин превращается в восстановленный нингидрин. Нингидрин, восстановленный нингидрин и аммиак затем конденсируются с образованием окрашенного соединения. Интенсивность окраски определяется фотоколориметрическим методом анализа, в основе которого лежит способ построения градуировочного графика.

Аминокислоты в белковых гидролизатах предварительно разделяют бумажной, ионообменной хроматографией или электрофорезом. Известен большой ряд реакций, лежащих в основе методов определения аминокислот: биуретовая, ксантопротеиновая, нитропруссидная, реакции Паули, Адамкевича и Вуазене, Сакагучи и др.

В таблице 6 по результатам анализа приведена расшифровка аминокислот белков муки.

Большое внимание уделяется определению общего содержания белка в пищевых объектах. Обычно определение проводят с использованием метода Къельдаля. Он основан на мокром сжигании материала в серной кислоте с использованием катализаторов: Na₂SO₄, CuSO₄, Se, H₂O₂. В результате выделяющийся аммиак вступает в реакцию с серной кислотой:

2NH₃ + H₂SO₄ = (NH₄)₂SO₄

Затем проводят отгонку NH₃:

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH = 2NH₃ + Na₂SO₄ + 2H₂O

Аммиак поглощают избытком 0, 1 н раствора H₂SO₄ и титруют избыток H₂SO₄ 0, 1 н раствором NaОН в присутствии фенолфталеина:

H₂SO₄ + NaOH = Na₂SO₄ + H₂O

Таблица 6

Аминокислотный состав белков муки (в г на 100 г белка)

Рассчитывают содержание азота в %.

Для перевода количества азота в содержание белка используют коэффициент 6, 25. Принят он потому, что большинство белков содержат 16% азота (100: 16 = 6, 25).

Для пшеницы получен коэффициент 5, 7, т.к. ее белки содержат 17, 5% азота. Для ржи, ячменя, овса, семян подсолнечника также 5, 7; сои – 5, 8; кукурузы – 6, 25; молока – 6, 38 и т.д.

По методу Къельдаля созданы высокопроизводительные, модифицированные, автоматические анализаторы типа «Къельфос».

Имеются и другие методы определения азота, такие как Дюма, нейтронно-активационный, с фенолятгипохлоритом на приборе «Техникон». Метод Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота (N₂). В нейтронно-активационном методе атомы азота анализируемого образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа ¹³N. Содержание белка рассчитывается по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе «Техникон» осуществляется фотоколориметрическим способом. Измеряется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся в процессе минерализации образца с щелочным раствором фенола и гипохлорита.

Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в специальных приборах-анализаторах.

Известен нефелонометрический метод определения белка, основанный на различной степени помутнения.

Рефрактометрические методы основаны на способности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочерный и др.) и преломлять лучи света.

5. Методы исследования липидов

в пищевом сырье и продуктах переработки

Методы исследования липидов зависят от строения и состава липидов, жирнокислотного состава масел и жиров и претерпевают сложные стадии пробоподготовки.

Липиды (от греческого слова lipos-жир) широко распространены в природе и вместе с белками и углеводами составляют основную массу органических веществ всех живых организмов, являясь обязательным компонентом каждой клетки. В растениях липиды накапливаются, главным образом, в семенах и плодах.

По химическому составу липиды являются производными жирных кислот, спиртов, альдегидов, построенных с помощью сложноэфирной, простой эфирной, фосфоэфирной, гликозидной связей. Их делят на две основные группы: простые и сложные.

Таблица 7

Содержание липидов в семенах и плодах растений

К простым нейтральным липидам (не содержащим атомов азота, фосфора, серы) относят производные высших жирных кислот (табл. 8) и спиртов: глицеролипиды, воски, эфиры холестерина, гликолипиды и др.

Таблица 8

Основные карбоновые кислоты,