Лабораторна робота №6

Тема: Методи виділення і культивування мікроорганізмів.

Матеріали та обладнання. 1) термостат; 2) чашки Петрі; 3) конічні колби (0, 2-0, 5 л); 4) електроплитка; 5) бактеріологічні петлі та препарувальні голки; 6) фільтрувальний папір; 7) стерильні пробірки; 8) МПА; 9) сіно; 10) картопля; 11) чисті культури на МПА.

Мета роботи: виділення чистих і елективних культур.

Основні відомості. Серед мікробних культур розрізняють чисті та елективні. Чистою називають культуру одного виду мікробів, що походить з однієї клітини або спори. Елективні культури (культури нагромадження) одержують на елективних середовищах при певних умовах культивування. Для цих культур використовують середовища, склад яких найкраще задовольняє потреби певної групи мікроорганізмів. Наприклад, у середовищах для культивування хемо- і фотоавтотрофних бактерій не повинно бути органічних речовин.

Вивчення властивостей бактерій та інших мікроорганізмів, як правило, проводять на чистих культурах. Найчастіше отримують чисті культури з попередньо виготовлених елективних культур. З цією метою використовують різні методи, залежно від мети досліджень і властивостей вихідного матеріалу.

Якщо в досліджуваному матеріалі містяться різні види мікроорганізмів, то основним завданням є одержання ізольованих колоній цих мікробів шляхом пересівання їх на поверхні твердого поживного середовища. Для цього застосовують: метод розведень, метод виділення чистої культури з окремої колонії, метод виділення чистої культури з однієї клітини та інші.

Метод розведень ввів у практику Л. Пастер. Згідно з цим методом досліджуваний матеріал, який містить мікроорганізми, за допомогою петлі переносять у пробірку з рідким стерильним поживним середовищем і старанно розмішують. Потім з цієї пробірки петлею переносять матеріал у нову, і так повторюють, змінюючи 5-6 пробірок доти, поки не одержать розведення, в якому буде тільки одна клітина. Проте цей метод зараз майже не застосовують, оскільки він має ряд недоліків.

При виділенні чистих культур і культивуванні мікробів часто проводять їх посіви і пересіви. Техніка посіву є простою. Наприклад, невеличку кількість досліджуваного матеріалу петлею вносять у посудини з рідким поживним середовищем.

Тверде поживне середовище треба спочатку приготувати: розлити розплавлений і охолоджений до 50º С МПА чи інше середовище. Стерильні чашки Петрі виставляють на рівну поверхню, обпалюючи на спиртівці отвір пробірки з середовищем, піднявши кришку чашки з одного боку, наливають поживне середовище, обережно закривають чашку кришкою і заливають до застигання агару.

Посів у чашки Петрі. Піднявши край чашки проводять посів петлею або шпателем (рис.22) і закривають чашку. Позначають і розміщують її у термостаті догори дном, щоб крапельки води, які утворюються з пари на кришці чашки, не потрапили на поверхню середовища і не розмивали ізольовані колонії.

Рисунок 5. Посів на пластинку МПА у чашці Петрі

Посів на косий агар у пробірках. Лівою рукою горизонтально тримають пробірку з середовищем. Правою рукою беруть петлю, обпалюють її на полум’ї спиртівки, охолоджують і вводять в посудини з досліджуваним матеріалом. Виймають пробку з пробірки, обпалюють отвір пробірки на спиртівці, вводять петлю в пробірку і зигзагоподібними рухами розсівають культуру по поверхні косого агару. Виймають петлю, знову обпалюють край пробірки (і пробку), закривають пробірку і ставлять у термостат.

Посів уколом у стовпчик МПА застосовують для вирощування анаеробів, для виявлення характерних ознак бактерій або з метою тривалого зберігання культур (рис.23).

Рисунок 6. Методи посіву мікроорганізмів: а – на косий агар у пробірках; Б – уколом у стовпчик МПА.

Отже, у дослідженнях по виділенню чистих культур різних організмів (бактерій тощо) входять такі операції: 1) посів досліджуваного матеріалу; 2) виділення чистої культури; 3) ідентифікація цієї культури.

Одержання елективних культур (на прикладі сінної палички). Вперше термін сінна паличка (Bacillus subtillis) був введений К.Еренбергом у 1838 р. Ф.Кон у 1875 р. виділив її з настою сіна і докладно описав як дрібну спороносну паличку. Вона належить до аеробних (дуже поширених у природі) амоніфікуючих бактерій, які викликають розпад білкових речовин рештків рослинних і тваринних організмів.

Проведення роботи. Для одержання елективної культури сінної палички у конічну колбу (об’ємом 0, 3-0, 5 л) вміщують 10 г свіжого сіна, наливають 200 мл води, додають грудочку крейди (для нейтралізації) і кип’ятять протягом 20-30 хв. За цей час з сіна в розчин переходять поживні речовини і водночас гинуть майже всі неспороносні та переважна кількість спороносних бактерій. Спори сінної палички витримують кип’ятіння протягом 2 год. Одержаний сінний настій розливають у стерильні колби шаром 1-2 см, щоб краще відбувалась аерація, колби закривають ватою і розміщують у термостаті за температури 30º С на 2-3 доби. Якщо сінний настій перед цим стерилізували, то для зараження бактеріями в колбу опускають кілька стебелець сухого сіна.

Рисунок 7. Розвиток сінної палички: 1 – молода клітина; 2 – клітина без джгутиків; 3 – поділ клітин; 4 – утворення джгутиків у ланцюжку; 5 – утворення спор у клітинах

На поверхні настою, який витримували в термостаті 2-3 доби, утворюється добре помітна тоненька бактерійна плівка. З неї виготовляють препарати «роздавлена» або «висяча» крапля і вивчають їх під мікроскопом з сухим або імерсійним об’єктивом. У полі зору добре видно поодинокі та з’єднані в нитки (стрептобактерії) клітини сінної палички (рис.24).

Питання для самоперевірки

1. Чисті культури мікроорганізмів.

2. Елективні культури мікроорганізмів.

3. Методи одержання чистих культур.

4. Одержання елективних культур.