Лабораторна робота №8

Тема: Дослідження мікрофлори грунту.

Матеріали та обладнання: 1) апарат для збовту­вання рі­дини; 2) терези і важки; 3) водяна баня; 4) електроплитка; 5) мікроскоп; 6) пред­метні та накривні скельця; 7) стери­льні пробірки та піпетки; 8) конічні колби; 9) сухий поживний агар; 10) досліджуваний грунт; 11) стерильні чашки Петрі; 12) апарат для підраху­нку колоній; 13) карболовий еритро­зин.

Мета роботи: опанувати методику мікробіологічного дослідження грунту

Основні відомості. У процесах ґрунтоутворення мікроорганізмам належить надзвичайно важлива роль. Адже під впливом біологічного чинника виникає основна властивість грунту, яка відрізняє його від материнської по­роди – родючість.

Оскільки грунт є найкращим середовищем для життя переважної бі­льшості мікроорганізмів, мікрофлора грунту дуже різноманітна. У її складі: азотфіксуючі, нітрифікуючі та денітрифікуючі бактерії, целюлозорозкладачі, різні пігментні мікроорганізми, сірко- і залізобактерії, мікоплазми, актиномі­цети, гриби, водорості, найпростіші тощо. В грунті живуть аеробні, анаеро­бні, автотрофні, гетеротрофні, психрофільні, термофільні, галофільні та інші мікроорганізми.

З огляду на різноманітність мікрофлори грунту її досліджують різ­ними методами. Серед них: бактеріоскопічний, розроблений С. М. Виноград­сь­ким, метод пластинок обростання за М. Г. Холодним. Кількісний облік мікроорганізмів методом підрахунку на твердих поживних середови­щах, кількісно-якісний облік мікрофлори грунту за Д. М. Новогрудським, метод капілярів Б. В. Перфільєва і Д. Р. Габе, облік кількості бактерій у грунті за допомогою люмінесцентної мікроскопії за Д. Г. Зв’ягінцевим, облік бакте­рій в ризосфері за М. О. Красильниковим, облік ризосферної і кореневої мікроф­лори методом К. З. Теппер та інші.

Проведення роботи. Дослідження мікрофлори грунту будь-яким ме­тодом дає надійні результати тільки тоді, коли правильно відібрано грунтові зразки. При дослідженні оранки знімають верхній двосантиметровий шар і відбирають з глибини всього орного шару. При вивченні мікрофлори грунто­вого профіля роблять грунтовий розріз і відбирають проби з генетичних гори­зонтів (знизу доверху).

Рекомендується використовувати стерильний бур, лопату та ніж. Ві­дібрані зразки вміщують у стерильні скляні колби або в стерильні поліетиле­нові мішочки з етикетками, де позначено місце відбору зразка, горизонту тощо. Аналіз зразків необхідно проводити в той же день. Допускається ви­тримування зразків у холодному приміщенні не більше двох діб. При вису­шуванні зразків кількість мікробів різко знижується.

Для одержання середньої проби грунту необхідно змішати окремі зразки, кількість яких залежить від рельєфу та площі, звідки їх відібрано. Рекомендується з площі 100м² відбирати проби у трьох місцях, понад 100 м² - у п’яти, а з 1 га й більшої площі – у 15 місцях. Підготовлену середню пробу використовують для проведення аналізів, залежно від мети досліду викорис­товують той чи інший метод дослідження.

1. Бактеріологічний метод С. М. Виноградського (в модифікації О. Г. Шуль­гіної). Виготовляють мікропрепарати з грунтової суспензії і фарбують ерит­розином. Кількість бактерій у грунті визначають прямим підрахунком під мікроскопом.

Проведення роботи. Із середньої проби грунту відважують 5 г, розти­рають у ступці та вносять у конічну колбу об’ємом 250-300 мл, додають 50 мл стерильної водогінної води і збовтують протягом 5 хв на спеціальному апараті. Після осідання великих частинок (протягом 3-5 сек) стерильною градуюванню мікропіпеткою відбирають 0, 01 мл зависі суспензії та наносять ії на знежирене предметне скло. До суспензії на склі додають краплю 0, 01% - го розчину агару (агар заздалегідь промивають і виготовляють на дистильо­ваній воді). Суспензію перемішують з агаром і стерильним накривним скель­цем розподіляють по предметному склу за допомогою трафарету на площі 4 см². Після цього препарат підсушують, фіксують 96%-м спиртом і фарбують карболовим еритрозином (занурюють скло в розчин барвника і витримують протягом 30 хв, а при потребі до 24 год). Залишок фарби змивають, занурю­ючи препарат в воду (тильною стороною), підсушують і вивчають під мікрос­копом за допомогою імерсійної системи.

Кількість мікроорганізмів вивчають за такою формулою:

,

де q – середня кількість мікробів у полі зору; - площа мазка, см²; - площа поля зору, мкм²; 10⁸ - перерахунок на мкм²; С – розведення; V – об’єм досліджуваної суспензії.

Приклад. Щоб дістати точний результат, роблять підрахунок кількості мікробів у 100 полях зору мікроскопа. Далі визначають площу поля зору за формулою S=π r². Щоб одержати величину радіуса, вимірюють діаметр поля зору за допомогою об’єкт-мікрометра. Після цього визначають, скільки полів зору розміститься на площі препарату (4 см²). Для цього треба поділити площу препарату на площу поля зору. Одержану середню кількість мікроорганізмів у одному полі зору множать на кількість полів, які вміщує площа препарату. В результаті дістають кількість мікробів у 0, 01 мл суспензії. Знайдене число множать на 100, щоб одержати їх кількість у 1 мл суспензії. Для обчислення кількості бактерій в 1 г абсолютно сухого грунту, треба знайдене число помножити на ступінь розбавлення і поділити на масу абсолютносухого грунту, що міститься в 1 г сирого грунту.

2. Метод підрахунку на агарових пластинках. Цей метод за своєю точністю значно поступається перед методом С. М. Виноградського та дає тільки орієнтовні дані, переважно про кількість аеробних мікробів у грунті. Проте внаслідок простоти і доступності його дуже часто застосовують у навчальних мікробіологічних лабораторіях. Згідно з цим методом грунтову суспензію висівають на тверді поживні середовища, вирощують на них колонії, підраховують та аналізують вирощені мікроорганізми.

Проведення роботи. Із зразка досліджуваного грунту відважують 1 г і роблять серію розведень у стерильній воді для одержання грунтової витяжки. Розведення готують так: у стерильну мірну колбу об’ємом 100 мл вносять 1 г гунту, додають 99 мл стерильної води і збовтують впродовж 3 хв. Потім відстоюють 1, 5 хв і роблять наступне розведення (рис.10).

Для виготовлення кожного наступного розведення буреть окрему стерильну піпетку. У стерильні чашки Петрі стерильною піпеткою вносять 1 мл грунтової суспензії (наприклад, 1: 100 000) і розподіляють рівномірно по дну. Розплавлене стерильне середовище (МПА, БПА, КАА, грунтовий агар) із пробірки виливають у чашку і, обережно похитуючи її, перемішують поживне середовище з грунтовою суспензією. З одного розведення готують 4-5 таких чашок.

Після застигання середовища для видалення крапель води з кришок чашки Петрі підсушують, позначають і ставлять у термостат при температурі 28-30 °С на 3-5 діб. Потім підраховують (без відкривання кришки чашки) кількість колоній, що виросли на агарових пластинках. Найкращі результати одержуються при утворенні на чашках 20-50 колоній бактерій і 20-30 колоній грибів. Для підрахунку кількості колоній зручно користуватися спеціальними приладами для підрахунку колоній.

Рисунок 10. Схема виготовлення розведень та посіву ґрунтової суспензії в чашки Петрі

По закінченні підрахунків колоній визначають середнє з 4-5 чашок і множать на розведення, взяте для аналізу. У такий спосіб одержують кількість аеробних мікробів у 1 г сирого грунту. Для точних дослідів кількість мікроорганізмів визначається в 1 г повітряно-сухого, а найточніших - абсолютно сухого грунту. Для таких розрахунків треба водночас визначити вологість грунтової проби.

Кількість мікроорганізмів на 1 г повітряно-сухого грунту розраховують за формулою:

,

де А – кількість клітин мікробів у 1 г повітряно-сухого грунту; Б - середнє число колоній мікроорганізмів у чашці Пері; В – відповідне розведення грунтової витяжки; Г – кількість крапель у 1 мл рідини в піпетці; Д – наважка грунту, взята для аналізу.

3. Метод пластинок обростання (за М. Г. Холодним). На відміну від наведених вище, цей метод дає можливість вивчати цілі мікробні асоціації безпосередньо в грунті, тобто в природному середовищі.

Проведення роботи. На рівній поверхні грунту роблять гострим ножем розріз, глибина якого залежить від досліджуваного грунтового горизонту. До вертикальної стінки зрізу щільно прикладають стерильне знежирене предметне скло, на 2-3 см нижче від поверхні грунту. Зверху зріз закривають грунтом. Місце, де встановлено скло, позначають. Залежно від мети досліду скло витримують у грунті 10-15 днів, а іноді й кілька місяців. Після цього обережно ножем знімають замлю й виймають скло.

Поверхню скла, що була притулена до стінки грунтового розрізу, висушують на повітрі. Протилежну сторону скла витирають сухою ганчіркою. Препарат фіксують на полум’ї спиртівки. Потім предметне скло занурюють у банку з водою верхньою стороною донизу, внаслідок чого великі частинки грунту відмокають і падають на дно, а мікроби та дрібні частинки залишаються на склі. По закінченні промивання, препарат фарбують карболовим еритрозином (витримують від 30 хв до 24 год), висушують і вивчають під мікроскопом з імпресійною системою.

4. Груповий аналіз мікрофлори грунту. Диференційоване виділення з грунту різних фізіологічних груп мікроорганізмів та їхній аналіз можливі при використанні різних поживних середовищ.

Залежно від фізіологічної групи мікробів і методу досліджень застосовують різні елективні та диференціально-діагностичні поживні середовища (МНА, МПА, + сусло-агар, КАА, середовища Виноградського, Ешбі, Гільтая, Імшенецького, Чапека та інші). За допомогою цього методу одержують значно більшу кількість мікроорганізмів, ніж користуючись методом пластинок обростання.

Можна рекомендувати виявити і вивчити такі фізіологічні групи: спороносні та неспороносні (пігментоутворюючі) форми бактерій на МПА; групу бацил (B. subtilis, B. megaterium, B. cereus, B. idosus, B. mycodies та інші) на МПА + сусло-агар, мікробактерії на картопляному агарі, актиноміцети на КАА, гриби на сусло-агаровому середовищі тощо.

Проведення роботи. З грунтової проби відважують 10 г грунту, висипають в конічну колбу об’ємом 250 мл, доливають 90 мл стерильної води і збовтують на спеціальному апараті протягом 10 хв. Щоб осіли грубі частинки, суспензію відстоюють, а потім виготовляють з неї серію розведень, і висівають на різні поживні середовища. Водночас відбирають з середньої проби 10 г грунту для визначення вологості, щоб перерахувати результати досліду на абсолютно сухий грунт.

Посів на м’ясо-пептонний агар (МПА). 1 мл грунтової суспензії потрібного розведення вносять у стерильну чашку Петрі, сюди ж вливають 12 мл попередньо розплавленого і охолодженого до 45°С МПА і старанно перемішують. Коли ставиться завдання систематизувати мікрофлору за типом колоній, то краще посів робити на поверхні агарових пластинок. Для виявлення бацилярних форм мікробів за Є. М. Мішустіним використовують змішане поживне середовище з МПА і сусло-агару (у відношенні 1: 1). Перед посівом на це середовище грунтову суспензію прогрівають при температурі 70°С протягом 15 хв для звільнення її від вегетативних форм бактерій.

Засіяні чашки Петрі позначають і розміщують у термостаті при температурі 25-30°С на 3-5 діб. Облік кількості колоній проводять на 3-4 день. Вивчають культуральні та морфологічні ознаки мікроорганізмів і роблять відповідні висновки.

Посів на картопляний агар. Суспензію грунтового зразка (розведення ) висівають на поверхню картопляного агару в чашках Петрі, розміщують у термостаті при температурі 25-30°С і витримують 10-15 днів. За цей час на агарових пластинках з’являються плодові тіла міксобактерій різної форми і кольору. Препарати старанно вивчають візуально і мікроскопічно.

Посівний сусло-агар. На цьому середовищі можна виділити низку грунтових грибів: Mucor, Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Alternaria, Fusarium, Trichoderma та інші.

Перед змішуванням розплавленого сусло-агару з грунтовою суспензією до нього додають 2 мл стерильної молочної кислоти або 0, 5 г стерильної лимонної кислоти (на 1 л середовища). Посів грунтової суспензії проводиться так само, як і на м’ясо-пептонному агарі.

Мікроорганізми, які беруть участь у розкладі гумусових речовин, добре ростуть на водному агарі, а також на агаризованій грунтовій витяжці. Азотобактер і олігонітрофільні мікроорганізми можна виявляти на середовищі Ешбі.

Аеробні мікроорганізми, що розкладають клітковину, виявляють на рідкому поживному середовищі, склад якого розроблений О. О. Імшенецьким і Л. І. Солнцевою.

Нітрифікуючі бактерії можна вирощувати на рідкому поживному середовищі С. М. Виноградського, а денітрифікуючі бактерії – на середовищі Гільтая.

Кількісний і якісний аналіз груп мікроорганізмів. Після інкубації виймають з термостату чашки Петрі з посівами і спочатку обліковують кількість вирощених мікроорганізмів, а потім приступають до якісного аналізу. Насамперед колонії групують за культуральними ознаками.

З мікроорганізмів, що розвиваються на МПА і МПА+сусло-агар, виділяють такі групи: 1)бацили (слизисто-складчасті, шкірясто-складчасті, галузисті колонії тощо); 2)неспороносні бактерії (переважно плечасті колонії жовтого, оранжевого, білого та інших кольорів); 3)флуоресціюючі бактерії (колонії зеленуватого кольору); 4) актиноміцети (як безбарвні, так і пігментовані колонії), мікробактерії (дрібненькі, куполоподібні колонії, жовтого, рожевого та білого забарвлення).

Кількісний підрахунок бацил, що виросли на МПА + сусло-агарі, роблять через 2 доби після інкубації, а якісний аналіз – на 5 добу. Сінна паличка має дрібно-зморщені, переважно безбарвні, сухі колонії з хвилястим краєм. Картопляна паличка утворює тонкі, зморщені, сухі, шкірясті колонії сірувато-білого, рідше кремового кольору. B. megaterium має гладенькі білого або кремового кольору опуклі колонії з концентричними колами. B. cereus утворює плекасті матові колонії з хвилястим краєм.

На крохмале-аміачному агарі (КАА) на 7-10 день ідентифікують колонії актиноміцетів і мікобактерій. Актиноміцети утворюють колонії різної пігментації. Повітряний міцелій актиноміцетів має сіре, біле, зеленувато-сіре, рожеве та інше забарвлення; і характерний землистий запах. Мікробактерії утворюють дрібні куполоподібні колонії переважно жовтого кольору.

На картопляному агарі міксобактерії з роду Polyangium утворюють плодові тіла переважно червоно-коричневого кольору, а з роду Myxococcus – безбарвні або світло-рожеві плодові тіла.

На сусло-агаровому середовищі підрахунок кількості грибів проводять після двох діб інкубації, а ідентифікація родів – на 7-8 день. Mucor mucedo утворює щільні колонії міцелію жовтувато-білого або сріблясто-сірого кольору, колонії Rhizopus – темно-сірі, Aspergillus – переважно чорного і жовтого кольору, а Penicillium – зеленого.

На середовищі Ешбі облік мікроорганізмів проводять на 5-6 день інкубації. Тут добре ідентифікуються азотобактер і олігонітрофільні дріжджі. Колонії азотобактера – плекасті, слизисті, безбарвні; олігонітрофільих дріжджів - Lypomyces – слизисті, молочно-білого кольору.