Лабораторна робота №5

Тема: Виготовлення поживних середовищ для мікроорганізмів. Види стерилізації.

Матеріали та обладнання. Колби на 500 і 1000 мл, ватні корки, МПБ, сусло, агар, хімічні реактиви для приготування середовищ, технічна вага з ціною поділки не більше 0, 05г, шпателі для зважування. Стерилізатори, термостат, автоклав, водяна баня, піч Пастера, бактерицидна лампа, бактеріологічні фільтри, лабораторний посуд, чашки Петрі.

Мета роботи: Виготовити МПА та сусло-агар (або інші поживні середовища) для проведення лабораторних робіт. Ознайомитись з основними методами стерилізації, їх призначенням і практичним використанням, правилами миття, обробки та підготовки до стерилізації лабораторного посуду.

У лабораторних умовах мікроорганізми культивують на поживних середовищах, які мусять мати всі речовини, необхідні для їхнього росту. Конструктивні та енергетичні процеси у мікроорганізмів дуже різняться. Тому так само відрізняються їхні потреби у поживних речовинах. Універсальних середовищ, однаково придатних для росту всіх без винятку мікроорганізмів, не існує.

Основними компонентами будь-якого поживного середовища для культивування мікроорганізмів є сполуки вуглецю й азоту. Вони і визначають специфічність більшості поживних середовищ.

Автотрофні мікроорганізми використовують вуглекислоту як єдине джерело вуглецю, тому в середовище вносять NaHCO₃ або продувають повітря, збагачене CO₂.

Гетеротрофні мікроорганізми здатні використовувати різні вуглець-вмісні органічні сполуки – кислоти, спирти, вуглеводи, ароматичні сполуки.

Потреби мікроорганізмів в азоті задовольняються за рахунок азотовмісних сполук, в яких азот має різний ступінь окиснення (амонійні солі, нітрати, амінокислоти і молекулярний азот, а інколи білки і пептони).

Багато мікроорганізмів потребує наявності в середовищі т.зв. факторів росту (вітамінів, пуринів, піримідинів, амінокислот), які додають до середовища у вигляді чистих сполук чи у складі дріжджового або кукурудзяного екстрактів.

Крім джерел вуглецю та азоту і факторів росту для побудови речовин клітині необхідні сірка, фосфор та інші елементи, а також мікроелементи. Вони мають входити до складу поживного середовища у доступній для мікроорганізмів формі.

За компонентами прийнято розрізняти натуральні, або природні середовища невизначеного складу, і синтетичні середовища.

Натуральними зазвичай називають середовища, які складаються з продуктів тваринного або рослинного походження. До них належать овочеві чи фруктові соки, м’ясо, кров, молоко, відвари або екстракти, одержані з м’яса, риби, ґрунту, гною, овочів. Натуральні середовища використовують головною мірою для підтримування культур мікроорганізмів, нагромадження біомаси та їхньої діагностики. До числа натуральних середовищ, які часто використовують у лабораторній практиці, відносять м’ясо-пептонний бульйон і неохмелене пивне сусло.

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ). Основою для його виготовлення служить м’ясна вода, яку готують таким чином: пропущене через м’ясорубку волове м’ясо, звільнене від жиру, кісток, сухожиль, заливають подві йним об’ємом водопровідної води і витримують 2-4 год при температурі, близькій до кипіння, або при 15º С протягом 13-15 год. Настій кип’ятять годину з м’ясом, або без нього, фільтрують через кілька шарів марлі. До 1л одержаної м’ясної води додають 10г пептону і 5г хлористого натрію, pH МПБ 7, 0.

Для одержання м’ясо-пептонного агару (МПА) до МПБ додають 1, 5-2% агару. МПБ і МПА стерилізують при 1 атм 20 хв.

Солодове (неохмелене) сусло – середовище для культивування молочнокислих і оцтовокислих бактерій, дріжджів, мікроскопічних грибів та інших гетеротрофних мікроорганізмів.

Пивне сусло готують на пивоварних заводах з ячмінного солоду. До нього входять: вуглеводи (мальтоза, декстрини) азотовмісні сполуки, а також вітаміни групи В, органічні кислоти і мінеральні солі.

Для усунення білків сусло фільтрують, за допомогою сахариметра визначають у ньому концентрацію цукрі у градусах Балінга (º Б), які приблизно відповідають відсотковому вмісту цих речовин. Для культивування дріжджів і грибів використовують сусло з концентрацією 6-8º Б, для молочнокислих бактерій – 8-12º Б. Сусло, концентрація якого вища вказаної, розводять водопровідною водою.

Для приготування сусло-агару до сусла додають 1, 5-2% агару. Сусло і сусло-агар стерилізують при 0, 5 атм 20-30 хв.

Синтетичні середовища – це середовища, до складу яких входять певні хімічні компоненти, взяті в точно вказаній кількості. Їх використовують при дослідженні метаболізму мікроорганізмів. Існує багато прописів синтетичних середовищ, які забезпечують ріст різних мікроорганізмів.

Поряд з натуральними і синтетичними виділяють т.зв. напівсинтетичні середовища. Основним їхнім компонентом є синтетичні середовища, до яких додають у невеликій кількості речовини невизначеного складу: пептон (джерело азотного живлення), дріжджовий автолізат (джерело вітамінів групи В, піримідинових і пуринових основ), гідролізат казеїну (джерело амінокислот).

Елективні середовища призначені для виділення мікроорганізмів з місць їхнього природного існування. Вони забезпечують вибірковий розвиток певної групи мікроорганізмів, для якої характерні спільні фізіологічні властивості.

Диференціально-діагностичні середовища дають можливість швидко відрізнити одні види мікроорганізмів від інших або виявити деякі їхні особливості. До них належать: середовище Ендо – для виявлення бактерій кишкової групи, Сабуро – для виявлення патогенних дріжджів роду Candida та ін.

За консистенцією розрізняють рідкі, сипучі і тверді середовища.

Рідкі середовища широко використовують для нагромадження біомаси чи продуктів обміну мікроорганізмів, для підтримки і збереження в колекції культур мікроорганізмів, які погано розвиваються на твердих середовищах.

Сипучі середовища застосовують у мікробіологічній промисловості для культивування деяких продуцентів фізіологічно активних сполук. До таких середовищ відносять розварене зерно (пшениця, пшоно), висівки та ін.

Тверді середовища використовують для виділення чистих культур, з діагностичною метою – для опису колоній, характеру росту мікроорганізмів, для визначення кількості мікроорганізмів, їхньої антибіотичної активності, для збереження культур у колекціях тощо. Для ущільнення середовищ використовують агар або желатин.

Агар – складний полісахарид, який одержують із бурих водоростей. Містить 1, 5-4% мінеральних солей, 10-20% води і 70-80% полісахаридів, до складу яких входять галактози, пентози, органічні кислоти.

Желатин – білок, який одержують із виварених кісток, хрящів, сухожиль, луски. Желатин плавиться при температурі 25º С, яка нижча звичайної температури культивування багатьох мікроорганізмів (30-37º С). Ця властивість желатину обмежує його застосування для ущільнення середовища. Желатин використовують головною мірою для виявлення протеолітичної активності мікроорганізмів. Його додають до рідких середовищ у кількості 15-20%. Желатинові середовища стерилізують при 0, 5 атм 15 хв.