Види стерилізації

Стерилізація – процес, який передбачає знищення в об’єкті усіх вегетативних і спорових, патогенних і непатогенних мікроорганізмів.

Підготовка до стерилізації: посуд миють і висушують. Пробірки, колби, флакони закривають ватно-марлевим корком. Зверху на корки одягають паперові ковпачки (окрім пробірок). Чашки Петрі стерилізують загорнутими в папір по 1-5 штук, пастерівські піпетки по 3-15 штук. В верхню частину піпетки вкладають трохи вати для того, щоб попередити потрапляння матеріалу до рота. Під час роботи піпетки потрібно брати за верхній кінець. Градуйовані піпетки з ватним корком зверху, загортають кожну окремо у смужку паперу, для чого його нарізують смужками розміром (2-2, 5) Х (50-70) см. Лівий кінець загинають, накручують на піпетку, а верхній – закручують, або приклеюють. Посуд стерилізують сухим жаром при температурі 150 або 160, 190º С відповідно 2, 1 і 0, 5 годин або у автоклаві при тиску 1 атм. протягом 20-30 хвилин.

Фізичні методи включають: 1) стерилізацію сухим жаром (фламбування, сухим нагрітим повітрям), 2) стерилізацію вологим жаром (кип’ятіння, текучою парою при 100º С, дробову стерилізацію при температурі нижче, ніж 100º С, стерилізація парою під тиском з температурою вище 100º С, пастеризація), 3) стерилізацію фільтруванням (бактеріологічні фільтри), ультрафіолетовими променями, ультразвуком.

Засоби стерилізацію сухим жаром. Фламбуванням або пропалюванням, стерилізують бактеріологічні петлі, пінцети та інші металеві предмети.

Стерилізація сухим нагрітим повітрям здійснюється в спеціальних сушильних шафах (печі Пастера) з подвійними стінками. Зовні шафа облицьована теплонепроникним матеріалом, всередині – стінки металеві. У верхній частині шафи знаходиться термометр. Між теплонепроникною обшивкою і внутрішнім металом шафи на дні є автоматичний електронагрівальний елемент. В печі Пастера стерилізують чистий скляний посуд. Колби закривають ватними корками, накривають паперовими ковпачками і зав’язують. Чашки Петрі і пастерівські піпетки загортають пачками в пергаментний папір. При включенні сушильної шафи в електромережу, повітря всередині шафи нагрівається. При досягненні заданої температури відзначають час початку стерилізації. Режим стерилізації – при температурі 155-160º С, експозиція 2 год, при 165-170º С – 1-1, 5 год, при 180º С – 1 год. По закінченні часу стерилізації нагрівання припиняють і, лише коли температура знизиться приблизно до 45º С, шафу відкривають. Речовини, що запалюються, живильні середовища, гумові та пластмасові предмети стерилізувати сухим жаром не можна.

Засоби стерилізації вологим жаром. Кип’ятіння – засіб стерилізації інструментів (шприци, голки, пінцети, ножиці, скальпелі та ін..) і деяких гумових та скляних предметів в стерилізаторах, які мають решітку. На решітку кладуть два-три шари марлі або тонкий шар гігроскопічної вати. Шприци стерилізують у розібраному вигляді, в голки вставляють мандрени. Леза скальпелів і ножиці рекомендується обгортати марлею або ватою. В стерилізатор наливають воду (краще дистильовану) так, щоб вона повністю вкривала інструменти. Стерилізатор закривають кришкою. Кип’ятять 20-30 хвилин. Після стерилізацію воду обережно зливають, а інструментами користуються тільки після їхнього охолодження.

Стерилізація текучою парою. В основу цього способу покладений засіб дробної стерилізації (розроблений Тиндалем, 1877 р.) при різних температурних режимах не вище 100º С. Здійснюють стерилізацію в апараті Коха при 100º С 30-40 хв. Апарат являє собою металевий котел циліндричної форми з подвійним дном, що закривається кришкою з отвором для термометру і виходу пари. Всередині котла є спеціальна підставка з отвором для матеріалу, що стерилізують і нагрівальні елементи. На дно апарату наливають воду до рівня, про який судять за показами водомірної трубки.

Початком стерилізації вважають момент закипання води. Пара, що утворюється при цьому піднімається доверху безперервно до матеріалу який стерилізується. Стерилізацію проводять 3 дня підряд. Однократне прогрівання вбиває тільки вегетативні форми мікроорганізмів. Спори, які залишилися життєздатними в періоди між стерилізацією проростають у вегетативні форми. Стерилізація на наступний день викликає їхню загибель. На третій день прогрівання гарантує повну стерильність матеріалу. Ефективність дробної стерилізації залежить від проростання спор, а тому в проміжках між нагріванням матеріали витримують при кімнатній температурі (25º С). Дробну стерилізацію при 100º С можна проводити і в автоклаві, закритому не герметично, у тих же режимах. Текучою парою стерилізують живильні середовища і інші матеріали, що руйнуються при нагріванні їх вище 100º С (желатина, вуглеводи).

Тиндалізація – дробна стерилізація при температурах нижче 100º С. Стерилізацію здійснюють у водяній бані. Принцип цього способу той же, що і при стерилізації текучою парою. Кратність нагріву залежить від температур, що застосовуються: при 70-80º С протягом 3 діб, 60-65º С – 5 діб, 56-58º С – 6-7 діб. В перший день матеріали стерилізують 2 год., в наступні дні – по одній годині. В проміжках між прогріванням матеріал, що стерилізується витримують при кімнатній температурі для проростання спор. За допомогою тиндалізації при 56-58º С стерилізують матеріали, що руйнуються при більш високій температурі (колоїдні розчини, сироватка крові та ін..)

Автоклавування – стерилізацію парою під тиском з високою температурою, здійснюють в спеціальному апараті – автоклаві. В основі цього способу лежить нагрівання матеріалу, поміщеного в автоклав з герметично закритою кришкою, чистою насиченою парою під тиском вище атмосферного. При зустрічі насиченої пари з більш холодним об’єктом пара конденсується, перетворюючись на воду, в результаті чого виділяється велика кількість тепла, і температура об’єкту стерилізації швидко підвищується. Крім того, при конденсації пари відбувається зменшення її обсягу, що сприяє проникненню пари у внутрішні частини матеріалу. Обов’язковою умовою є надходження справді насиченої пари, щоб її торкання з холодним предметом вело до негайної конденсації і нагрівання та не призводило до вилучення води з матеріалу, який стерилізується. Сучасні автоклави електричні. Промисловість випускає автоклави вертикальні і горизонтальні.

Вертикальний автоклав являє собою двостінний металевий котел циліндричної форми, що закривається герметично кришкою. Через спеціальний кран з лійкою між стінками заливають воду до певного півня. Внутрішня стінка котла у верхній частині має отвір, в нижній частині – кран, через який при нагріванні води пара витісняє повітря з котла. Автоклав нагрівають включенням в електромережу. Автоклав завантажують матеріалом, кришу закривають герметично, закривають кран, через який заливають воду, нижній кран тимчасово залишається відкритим. При закипанні води між стінками автоклаву пара, що утворюється, піднімається доверху і через верхній отвір внутрішньої стінки потрапляє всередину котла, витісняючи повітря через нижній відкритий кран. Коли повітря все витиснеться і пара починає виходити рівним струменем, нижній кран закривають. В результаті тиск пари всередині автоклаву підвищується. Початком стерилізації вважають момент досягнення показань манометра заданої величини. Нагрівання регулюють протягом усієї стерилізації, підтримуючи тиск пари на одному рівні. При надмірному підвищенні тиску всередині автоклаву передбачений запобіжний клапан, через який автоматично надлишок пари виходить назовні.

При підвищенні тиску пари, відповідно підвищується і температура в автоклаві:

0, 505*10⁵ Па (0, 5 атм) температура 110-112º С

1, 01*10⁶ Па (1 атм) – 120-121º С

1, 515*10⁶ Па (1, 5 атм) – 124-126º С

2, 02*10⁶ Па (2 атм) – 132-133º С

Манометр показує тиск пари без врахування навколишнього атмосферного тиску (760 мм рт.ст.) По закінченню часу стерилізації автоклав відключають. Після охолодження при нульовій позначці манометру відкривають кран для того, щоб випустити пару. Кришку відкривають обережно на себе, не заглядаючи в котел, уберігаючи очі від можливої залишкової пари. До повного виходу пари відкривати кришку не можна. Бо при швидкому падінні тиску всередині автоклаву простерилізовані рідкі середовища закипають, корки з пробірок виштовхується разом з рідиною.

В автоклаві стерилізують живильні середовища, що витримують нагрівання вище 100 º С (МПА, МПБ, фізрозчин), скляний посуд, загорнутий в папір, перев’язувальний матеріал, халати. Крім того, в автоклаві знезаражують використані бактеріальні культури, посуд. В цих випадках тиск пари і експозиція стерилізації повинні бути тривалішими (1, 5 атм – 1 год.), ніж при стерилізації чистого матеріалу (0, 5 атм – 30-40 хв.). Для перевірки якості роботи автоклаву, відповідність показів манометра і температури пари використовують різноманітні хімічні речовини (бензонафтол, сірка), які мають певну температуру плавлення.

Горизонтальний автоклав відрізняється від вертикального конструкцією, але принцип роботи той же. Пастеризація – спосіб запропонований Пастером з метою збереження біологічної цінності харчового продукту (молоко, м’ясні, рибні і овочеві консерви), що знижується при кип’ятінні (руйнуються вітаміни і інші нестійкі до високої температури речовини). При пастеризації продукт нагрівають до 80 º С 30 хв., після цього різко охолоджують (до 4-8 º С). Пастеризацією досягається часткова стерилізація – гинуть вегетативні форми бактерій, а спори зберігаються. Різке охолоджування і наступне зберігання при низькій температурі (4-5 º С) перешкоджають проростанню спор і наступному розмноженню бактерій.

Стерилізація фільтруванням полягає в пропусканні рідкого матеріалу через бактеріологічні фільтри шляхом створення на фільтрі перепаду тиску, або шляхом створення вакууму в приймальникові фільтрату. Дія фільтру полягає в механічній затримці і в адсорбції мікроорганізмів стінками пор фільтру. Розміри мікробів часто бувають менші середнього діаметру пор фільтрів. Фільтрують звичайно рідини, які не витримують нагрівання (сироватки крові, розчини антибіотиків та ін..). Фільтри бувають тверді – керамічні, азбестові і мембранні.

Більш часто в роботі використовують фільтри Зейтца і мембранні фільтри, які вмонтовані в спеціальному утримувачі-лійці, вставленому в корок, що закриває колбу Бунзена (товстостінна колба з тубусом). Змонтований фільтр загортають папером і стерилізують в автоклаві. Рідину, яка фільтрується наливають у лійку над фільтром, на тубус колби надягають гумову трубку, приєднану до ручного або електричного насоса, викачуванням повітря з колби створюють понижений тиск, і рідина фільтрується, бактерії залишаються на фільтрі. Стерильність отриманих фільтратів перевіряють посівом на живильні середовища з наступним інкубуванням в термостаті протягом декількох діб.

Стерилізація ультрафіолетовим промінням. В лабораторії джерелом УФ-опромінення служать спеціальні бактерицидні лампи. Ці промені використовують для знезараження повітря в приміщеннях (боксах, операційних). Бактерицидні лампи знайшли також своє застосування в харчовій промисловості при зберіганні різноманітних продуктів (температура вище 0 º С).

Ультразвук, як фізичний стерилізуючий чинник, може бути використаний, наприклад, для знезараження води, молока, деяких продуктів. Стерилізуюча дія ультразвуку пов’язана з виникненням в цитоплазмі бактерій кавітаційних міхурців, заповнених парою з тиском біля 10 тис. атм., внаслідок чого руйнуються внутрішні структури бактеріальної клітини.

Стерилізація за допомогою хімічних речовин в лабораторній практиці має обмежене застосування і зводиться до консервування, з метою попередження бактеріального забруднення живильних середовищ, вакцин, а також лікувальних і діагностичних сироваток різноманітними хімічними сполуками (солі металів, луги, антибіотики і ін..) Живильні середовища консервують хлороформом, толуолом, інколи ефіром (для звільнення від консерванту середовище нагрівають до 56 º С). Вакцини і лікувальні сироватки консервують фенолом (0, 25-0, 5%-им), хлороформом (0, 5%).

Хімічні речовини застосовують в лабораторіях і для дезінфекції.

Дезінфекція – це знищення патогенних мікроорганізмів в об’єктах зовнішнього середовища. Навіть у фіксованих і зафарбованих мазках іноді зберігаються збудники деяких хвороб. Тому дезінфекція в бак лабораторії – це обов’язковий повсякденний захід. Дезінфекції не підлягає лише той посуд, де культивувались мікроорганізми; його складають в бікси, пломбують і здають в стерилізацію.

Питання для самоперевірки

1. Призначення живильних середовищ і вимоги до них.

2. Класифікація живильних середовищ.

3. Культивування аеробів.

4. Культивування анаеробів.

5. Поняття «стерилізація», «дезінфекція», їх застосування у практиці.

6. Методи стерилізації.

7. Автоклав, його будова та призначення.

8. Стерилізація сухою парою.