Лабораторна робота №14. Тема:Симбіотичні азотофіксатори (ознайомлення з бульбочковими бактеріями).

Тема: Симбіотичні азотофіксатори (ознайомлення з бульбочковими бактеріями).

Матеріали та обладнання: мікроскопи, предметні та накривні скельця, спиртівки, бритви, скальпелі, препарувальні голки, фіксовані у формаліні або свіжі корені з бульбочками різних бобових рослин, розчин фуксину.

Мета роботи:

1. Ознайомитись з бульбочковими бактеріями гороху овочевого.

2. Вивчити під мікроскопом препарат «роздавлена крапля» зі зрізу бульбочки.

Азот є одним із елементів, від якого залежить доля врожаю рослин. Він є невід’ємним складником білків, ДНК і РНК, АТФ, ферментів та інших важливих сполук усіх живих організмів. У середовищі, яке оточує рослину, азот перебуває у вигляді газоподібної молекулярної сполуки (N ), що становить близько 80 % об’єму повітря, а також у вигляді різних мінеральних і органічних сполук, які містяться в грунті, морях та океанах. Зокрема в грунті зв’язаний азот трапляється у вигляді солей амонію (), нітратного і нітратного азоту (), білкового азоту (рештки рослинних і тваринних організмів) і азоту, що входить до складу грунтового гумусу.

Перетворення сполук азоту в грунті – складний процес. Він відбувається по-різному: гниття білків, або амоніфікація; окислення амонійних форм азоту, або нітрифікація; відновлення нітратів до молекулярного азоту – денітрифікація; фіксація молекулярного азоту атмосфери вільноживучим і симбіотичними мікроорганізмами.

Основні відомості. Бульбочкові бактерії, які живуть у симбіозі з бобовими рослинами, належать до роду Rhizobium. У молодих бульбочках вони мають форму рухливих паличок з перитрихальним розміщенням джгутиків. З розвитком бульбочки бактерії втрачають джгутики, стають нерухомими, розростаються і перетворюються на розгалужені форми – так звані бактероїди. Дослідження показують, що саме в цій стадії відбувається найінтенсивніше зв’язування бактеріями молекулярного азоту.

Бульбочкові бактерії характеризуються вірулентністю, специфічністю і активністю. Вірулентність – здатність бактерій проникати в тканину кореня, розмножуватися там і спричиняти утворення бульбочок. Бульбочкові бактерії можуть заражати лише певну групу бобових рослин. Вибіркова здатність їх відносно рослини дістала назву специфічності, а здатність у симбіозі з рослинами асимілювати молекулярний азот – активності.

Проведення роботи. З бульбочок коренів люпину, гороху або з квасолі бритвою роблять тоненькі поперечні та повздовжні зрізи. З них роблять препарати «роздавлена крапля» і вивчають під мікроскопом при сухій та імерсійній системах (рис.14).

Щоб виготовити фіксовані препарати, зріз бульбочки або маленьку бульбочку роздавлюють на предметному склі та з вичавленої маси роблять мазок. Висушений мазок фіксують на полум’ї спиртівки і фарбують фуксином, карболовим еритрозином або генціанвіолетом. Добрі результати одержуються при фарбуванні препаратів сумішшю рівних частин метиленового синього і фуксину, розчинених у 1 %-му розчині .

Рисунок 14. Бульбочкові бактерії: А – палички; Б – бактероїди.

Для цього витримують препарату суміші фарб протягом 3-5 хв. Тканина бульбочки фарбується у синій колір, а бактерії – в червоний. Препарати старанно вивчають і зарисовують у протоколах робіт.

Для виділення чистої культури бульбочкових бактерій беруть корінець з бульбочкою, старанно промивають у стерильній воді, стерилізують поверхню бульбочки розчином спирту і знову промивають стерильною водою. Потім роздавлюють бульбочку в краплі стерильної води і одержану суспензію висівають у чашки Петрі на бобовий агар або середовище Фреда. Засіяні чашки витримують у термостаті при температурі 25-27°С протягом 7 діб (залежно від форм, які вирощуються – повільних чи швидкоростучих).

Питання для самоперевірки

1. Поняття про симбіоз.

2. До якого роду належать бульбочкові бактерії?

3. В якій стадії бактерії найінтенсивніше зв’язують атмосферний азот?

4. Якими особливостями характеризуються бульбочкові бактерії?

5. Утворення бактероїдів.

Література:

1. Векірчик К.М. Мікробіологія з основами вірусології: Підручник.- К.: Либідь, 2001. – 312 с.

2. Векірчик К.М. Практикум з мікробіології: Навчальний посібник.- К.: Либідь, 2001. – 144 с.

3. Гудзь С. П. та ін. Основи мікробіології. – К.: УМК ВО, 1991. – 236 с.

4. Гудзь С. П., Гнатуш С. О., Білінська І. С. Практикум з мікробіології. Частина перша. Навчальний посібник. – Львів: Видавничий центр ЛНУ імені Івана Франка, 2003. – 80 с.

5. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. – М.: Медицина, 1972. – 480 с.

6. Пяткін К. Д., Кривошеїн Ю. С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією. – К.: Вища школа, 1992. – 431 с.

7. Ситник І. О., Климнюк С. І., Творко М. С. Мікробіологія, вірусологія, імунологія. – Тернопіль: Укрмедкнига, 1988. – 392 с.

8. Теппер Е. З. Практикум по микробиологии / Е. З. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзева. – 3 – е изд., перераб. и доп. – М.: Агропромиздат, 1987. – 239 с.

9. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. – Москва: Мир, 1987. – 567 с.

Додаткова література:

1. Беляев С. С. Метанобразующие бактерии: биология, систематика, применение в биотехнологии // Успехи микробиол. — 1988. — Т. 22. — С. 169.

2. Биохимия и физиология метилотрофов. — Пущино, 1987.

3. Войткевич Г. В. Происхождение и химическая эволюция Земли. — М.: Наука, 1983.

4. Воробьева Л. И. Техническая микробиология. — М.: Изд-во МГУ, 1987.

5. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. — М.: Мир, 1982.

6. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология: В 3-х т. – Москва: Мир, 1990.

7. Гринюс Л.Л. Транспорт макромолекул у бактерий. — М.: Наука,. 1986.

8. Громов Б. В. Строение бактерий. — Л., 1985.

9. Громов Б. В., Павленко Г. В. Экология бактерий. — Л., 1989.

10. Жизнь микробов в экстремальных условиях. — М.: Мир, 1981.

11. Кондратьева Е. Н. Хемолитотрофы и метилотрофы. — М.: Изд-во МГУ, 1983.

12. Кондратьева Е. Н., Максимова И. В., Самуилов В. Д. Фототрофные микроорганизмы. — М.: Изд-во МГУ, 1989.

13. Нетрусов А. И. Энергетический метаболизм метилотрофных микроорганизмов. — М., 1989.

14. Перспективы биохимических исследований. — М.: Мир, 1987.

15. Промышленная микробиология/Под ред. Н. С. Егорова. — М.: Высшая школа, 1989.

16. Розанова Е. П., Назина Т. Н. Сульфатвосстанавливающие бактерии (систематика и метаболизм) // Успехи микробнол. — 1989. — Т. 23.— С 191

17. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов. — М.: Мир, 1979. — Т. 1—3.

18. Фототрофные микроорганизмы. — Пущино, 1988.

19. Хемосинтез: к 100-летию открытия С. Н. Виноградским. — М.: Наука, 1989.

20. Xмель И.А. Плазмиды и эволюция микроорганизмов // Успехи совр. биол. — 1985. — Т. 99. — С. 323.