Практичне заняття №12

Тема: «Серологічні реакції (2 заняття)»

1. Актуальність теми:

У захисті організму від чужорідних агентів вирішальну роль відіграють імунологічні механізми, які здійснюються антитілами (імуноглобулінами) та імунокомпетентними клітинами (лімфоцитами). В основі імунологічних механізмів є специфічна взаємодія антигену, що потрапив в організм, та антитіла, що утворилось у відповідь на потрапляння антигену. На використанні принципу взаємодії антигену та антитіла базуються всі імунологічні діагностичні реакції, які названі серологічними, оскільки антитіла знаходяться в сироватці крові. Застосування серологічних реакцій з метою серодіагностики інфекційного захворювання та з метою сероідентифікації збудників, що виділені від хворого, є необхідним для встановлення заключного діагнозу інфекційного захворювання. На занятті студентам надається можливість оволодіти методикою постановки основних серологічних реакцій (реакція аглютинації, реакція пасивної гемаглютинації, реакція гемолізу). Розуміння ролі антитілоутворення у формуванні імунної відповіді є необхідним підгрунтям для формування уявлення про складний механізм функціонування імунної системи та її ролі у розвитку імунозалежних патологій. Вміння обирати потрібні для діагностики інфекційного захворювання серологічні реакції, ставити їх та інтерпретувати отримані результати є важливим для формування у студентів клінічного мислення і розуміння суті патологічного процесу при інфекційних хворобах.

2. Конкретні цілі:

· Аналізувати механізм взаємодії антитіл з антигенами

· Знати закономірності серологічних реакцій

· Інтерпретувати участь клітин імунної системи в імунній відповіді і фази імунної відповіді

· Вміти проводити облік результатів розгорнутої реакції аглютинації, поставленої з метою серологічної ідентифікації

· Оволодіти методикою постановки реакції аглютинації, поставленої з метою серологічної діагностики (реакція Відаля)

· Оволодіти методикою постановки реакції імунного гемолізу

· Засвоїти методику постановки реакції непрямої гемаглютинації

3. Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція). Дивись практичне заняття №10.

4. Завдання для самостійної роботи під час підготовки до заняття.

4.1.Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:

4.2. Теоретичні питання до заняття:

· Діагностикуми, їх характеристика, принципи отримання і практичне використання.

· Трьохкомпонентні та багатокомпонентні серологічні реакції (імунного лізису, реакція зв’язування комплементу, опсонофагоцитарна, непрямої аглютинації), їх суть, практичне використання.

· Система комплементу, шляхи її активації, біологічне значення.

· Реакція імунного гемолізу, механізм, практичне використання.

· Оцінка результатів серологічних реакцій і висновки.

· Реакції бактеріолізу, цитолізу, їх механізм та практичне використання.

4.3. Практичні завдання, які виконуються на занятті:

· Провести облік розгорнутої реакції аглютинації, поставленої з метою серологічної ідентифікації культури бактерій.

· Поставити реакцію Відаля для серологічної діагностики черевного тифу.

· Здійснити облік результатів РНГА, поставленої з метою серодіагностики черевного тифу, зробити висновок

· Провести облік результатів реакції імунного гемолізу, зробити висновок.

· Вивчити зразки діагностикумів.

5. Зміст теми:

На практичному занятті студенти знайомляться зі складними серологічними реакціями, розглядають особливості постановки та компоненти реакції аглютинації і методику постановки реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) з метою серологічної діагностики інфекційних захворювань. Студенти проводять облік реакції аглютинації, поставленої з метою ідентифікації культури бактерій; ставлять реакцію Відаля для діагностики черевного тифу; здійснюють облік РНГА, поставленої з метою серодіагностики черевного тифу; ставлять реакцію імунного гемолізу; вивчають зразки діагностикумів. Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.

Рекомендації для оформлення протоколу.

5.1. Облік поставленої на попередньому занятті реакції аглютинації з метою серологічної ідентифікації культури бактерій.

Студенти проводять остаточний облік поставленої на попередньому занятті реакції аглютинації з метою ідентифікації культури бактерій. Ступінь позитивної реакції аглютинації позначається плюсами:

++++ - повна аглютинація, рідина прозора, а на дні значна кількість білого осаду;

+++ - рідина не зовсім прозора, осад менший;

++ - рідина непрозора, осад ще менший;

+ - рідина мутна, дуже незначний осад;

- - рідина рівномірно мутна, як в контролі антигену; осад відсутній. Результат в цьому випадку вважають негативним.

Відповідність між видом мікроба і діагностичною аглютинуючою сироваткою вважається достовірною при умові чітко вираженої реакції аглютинації в пробірках з розведенням сироватки в межах титру, але не менше 2/3 її титру при відсутності осаду в контролях сироватки і культури.

5.2. Постановка реакції аглютинації з метою виявлення антитіл в сироватці хворого з підозрою на черевний тиф та паратифи А та В.

Для проведення реакції беруть у хворого кров, одержують з неї сироватку і розводять ізотонічним розчином натрію хлориду від 1: 50 до 1: 800 за схемою. Як антиген в цій реакції використовують діагностикуми – суспензії із відомих убитих мікроорганізмів – черевного тифу та паратифів А та В.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦІЇ АГЛЮТИНАЦІЇ З МЕТОЮ ВИЯВЛЕННЯ АНТИТІЛ В СИРОВАТЦІ КРОВІ ХВОРОГО

№ пробірки Інгредієнти (в мл)	Дослідні	Контрольні
Фізіологічний розчин	1, 0	1, 0	1, 0	1, 0	1, 0	1, 0	---
Сироватка крові хворого в розведенні 1: 25 (0, 1 мл с-ки + 2, 4 мл фіз.розчину)	1, 0	1, 0	1, 0	1, 0	1, 0	В дез. Р-н.   ---	1, 0
Діагностикум	0, 1	0, 1	0, 1	0, 1	0, 1	0, 1	---
Отримані розведення сироватки	1: 50	1: 100	1: 200	1: 400	1: 800	КД	КС

Штатив з пробірками поміщають в термостат при 37⁰С. Попередній облік реакції проводять через 2 години, а остаточний – через 18-20 годин.

5.3. Принцип постановки та облік результатів реакції непрямої гемаглютинації (РНГА), поставленої з метою серологічної діагностики.

Суть реакції непрямої гемаглютинації полягає в тому, що еритроцити, на поверхні яких адсорбовані будь-які розчинні антигени, набувають здатності аглютинуватись при взаємодії з антитілами, специфічними до адсорбованого антигену. Еритроцити, що сенсибілізовані антигенами, називаються еритроцитарними діагностикумами. Найчастіше використовують еритроцити барана, яким властива висока адсорбуюча активність. Реакцію ставлять за такою схемою: в пробірках або лунках прогріту впродовж 30 хв. при 58⁰ С досліджувану сироватку розводять послідовно від 1: 10 до 1: 320 в об’ємі 0, 25 мл та додають по 2 краплі еритроцитарного діагностикуму. Реакцію супроводжують контролями: на спонтанну аглютинацію сенсибілізованих еритроцитів, контроль з нормальними еритроцитами, а також контролі діагностикумів з завідомо позитивною та негативною сироватками. Після легкого струшування пробірки або лунки витримують в термостаті 30-45 хв. при 37⁰ С. Облік результатів реакції здійснюють після того, коли випадуть в осад еритроцити у відповідних контрольних пробірках. Достовірними результатами слід вважати відсутність гемаглютинації в контролях з нормальними, сенсибілізованими еритроцитами, з завідомо негативною сироваткою і наявність гемаглютинації і з завідомо позитивною сироваткою. Гемаглютинація в дослідних пробірках при відповідних контролях свідчить про наявність специфічних антитіл в досліджуваній сироватці. Результати оцінюють за зовнішнім виглядом осаду еритроцитів в лунках. В позитивному випадку (+) еритроцити рівномірно у вигляді “парасольки” покривають майже все дно пробірки або лунки. При негативному результаті (-) еритроцити осідають у формі компактного комочка – “гудзика”.

5.4. Постановка реакції імунного гемолізу.

Імунний лізис – це розчинення клітин (антигенів) під дією специфічних антитіл (лізінів) в присутності комплементу. В залежності від антигенів, що беруть участь в реакції лізису, вона одержала назву бактеріолізу, спірохетолізу, гемолізу тощо. Найчастіше використовується в лабораторній практиці реакція гемолізу як індикаторна система в реакції зв’язування комплементу. Для постановки реакції потрібні: 1) антиген – 3% суспензія еритроцитів; 2) антитіло – гемолітична сироватка проти еритроцитів барана; 3) комплемент – сироватка морської свинки, розведена 1: 10; 4) ізотонічний розчин хлориду натрію.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ОСНОВНОГО ДОСЛІДУ РЕАКЦІЇ ГЕМОЛІЗУ

Всі пробірки ставлять в термостат на 30-45 хвилин при 37⁰ С, після чого проводять облік реакції. В даному випадку в дослідній пробірці повинен наступити гемоліз в результаті специфічної реакції між гемолітичною сироваткою і еритроцитами в присутності комплементу. В контрольних пробірках не повинно бути гемолізу, тому що в одній із них відсутній комплемент (контроль гемолітичної сироватки), в другій відсутня гемолітична сироватка (контроль комплементу), а в третій відсутні комплемент та гемолітична сироватка (контроль еритроцитів).

Питання для самоконтролю

· Що означають поняття “серологічна ідентифікація збудника захворювання” та “серологічна діагностика інфекційного захворювання”?

· Як класифікують серологічні реакції?

· Що являють собою і як отримують стандартні діагностикуми?

· Які серологічні реакції є багатокомпонентними?

· Що таке система комплементу? Які шляхи її активації?

· Що таке реакції лізису?

· Що таке реакція імунного гемолізу? Яка мета її застосування?

· Що таке реакція непрямої гемаглютинації? Яка мета її застосування?