Флуоресцентные зонды. Использование флуоресцентных зондов для исследования белков и биологических мембран.

Флуоресцентным зондом называется флуоресцирующая молекула, которая связывается с биологическими мембранами, белками, другими компонентами клетки нековалентными связями. Зонды представляют собой небольшие молекулы, сравнимые по размерам с мембранными фосфолипидами. Все зонды имеют гидрофобный радикал, но различаются по величине дипольного момента или наличием заряженных частиц, что определяет ло-кализацию зонда в субстрате. Флуоресцентные зонды подбирают таким образом, чтобы они связывались с белками не в любом месте, а желательно в активных центрах, участках связывания субстратов, ингибиторов или кофакторов. Особенность исследования биологических мембран заключается в том, что зонды взаимодействуют не только с мембранными белками, но и с мембранными фосфолипидами. Сродство мембран к зондам зависит также от заряда поверхности мембраны. Метод флуоресцентных зондов дает возможность исследовать поверхностный заряд мембраны, состояние ее гидратной оболочки, трансмембранный потенциал и градиент рН, связывание с мембраной различных лигандов (лекарств, гормонов). С использованием метода флуоресцентного зондирования создаются условия для выявления относительных изменений микровязкости мембран в за-висимости от температуры, получения информации о подвижности молекул, входящих в состав мембран. Под подвижностью молекул подразумевается латеральная диффузия в пределах одного слоя, флип-флоп переходы - перемещение молекул из одного слоя в другой и др. Например, по эффективности переноса энергии от зонда-донора, находящегося на одной стороне мембраны, к зонду-акцептору на другой ее стороне можно измерить толщину биологической мембраны. Флуоресцентные зонды применяют для определения степени связывания и локализации хромофора в мембране. Так, например, перемещение зон-да из полярной области мембраны в неполярную ее часть сопровождается увеличением интенсивности флуоресценции со сдвигом максимума спектра в коротковолновую область. Изучение интенсивности флуоресценции при введении флуоресцентных зондов в биомембраны и клетки позволяет выяснить изменение относительной микровязкости мембран в зависимости от температуры, действия многовалентных катионов, неполярных растворителей, концентрации ионов водорода и других факторов. В последнее десятилетие стали применять флуоресцентные зонды, чувствительные к изменению рН-среды (производные акридина), что позволило изучать изменение концентрации ионов водорода в разных участках клетки при протекании ряда физиологических процессов (дыхания, фотосинтеза и др.) и анализировать проникновение веществ через мембрану, метаболизм ряда веществ. С помощью флуоресцентных зондов можно исследовать молекулярные механизмы возникновения и развития патологических процессов, действие на организм биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Флуоресцентные зонды применяются также для диагностики и прогноза развития заболеваний, выявления факторов риска, что позволяет контролиро-вать эффективность лечения заболеваний.