Флуоресценция. Законы флуоресценции. Метод спектрофлуориметрии.

Флуоресценция - это физический внутримолекулярный процесс, в результате которого молекула за время, составляющее 10~8-10~9 с, переходит в основное состояние с испусканием кванта света. Принцип Франка — Кондона. Часть электронной энергии при поглощении и испускании света должна расходоваться на увеличение колебаний структуры, превращаться в тепло. Явление наблюдается в результате резкого изменения градиента электронной энергии около ядер при возбуждении и релаксации. (закон Стокса). Спектр флуоресценции относительно спектра поглощения сдвинут в более длинноволновую сторону. Данное правило принято объяснять потерей некоторой части поглощённой энергии на тепловое движение молекул. Так как в зависимости от подведенной энергии частица может перейти в энергетически разные возбужденные состояния, можно было ожидать прямой зависимости спектров люминесценции от спектра возбуждения источника. Правило Стокса используется в осветительной технике для преобразования ультрафиолетового излучения в видимый свет. Примером является ртутная лампа, в которой пары ртути, возбуждаемые электрическим разрядом, излучают ультрафиолет. На внутреннюю поверхность лампы нанесен слой люминофора с подходящим спектром люминесценции в видимой области. По сравнению с лампами накаливания такие лампы более экономичны. Правило Каши. Спектры флуоресценции не зависят от длины волны возбуждающего света. С точки зрения энергетических уровней, верхние возбужденные состояния, как правило, расположены более близко друг к другу, чем наинизшее возбужденное состояние (синглетное или триплетное) и основное состояние. В результате этого малого расстояния скорости безызлучательного перехода между верхними возбужденными состояниями значительно превышают скорость люминесценции с этих состояний, таким образом, люминесценция с верхних уровней не происходит. Только в нижнем возбужденном состоянии скорость излучательной релаксации становится сравнима со скоростью безызлучательной релаксации, в результате чего только низшее возбужденное состояние способно к люминесценции. Правило зеркальной симметрии (Левшина) выражает тот факт, что спектры поглощения и флуоресценции, построенные в шкале частот, приближенно симметричны относительно прямой, проходящей через точку их пересечения. В основе этого правила лежит часто наблюдающаяся на практике близость структуры и взаимного расположения колебательных подуровней основного и первого возбужденного электронных состояний молекул, а также практически одинаковый характер относительного изменения вероятностей переходов в пределах полос поглощения и флуоресценции. Закон Вавилова. Устанавливает зависимость выхода фотолюминесценции от длины волны возбуждающего света. Квантовый выход люминесценции - квантовый выход - отношение числа излученных квантов к числу поглощенных. Метод спектрофлуориметрии характеризуется исключительно высокой чувствительностью и специфичностью и и даёт универсальные возможности для изучения возбужденных состояний молекул, фотохимических реакций, динамики быстрых молекулярных процессов, структуры и свойств сложных химических и биологических объектов. С помощью данного метода можно изучать свойства флуоресцирующих веществ при концентрациях, гораздо ниже тех, которые требуются для измерения спектров поглощения. Измерение спектров флуоресценции проводят с помощью прибора, называемого спектрофлуориметром. Принцип работы спектрофлуориметра основан на выделении узких участков спектра как возбуждающего, так и испускаемого света и на выборе длин волн возбуждения и испускания с помощью монохроматоров при автоматизированном управлении работой прибора, регистрации и обработке результатов флуоресцентных измерений.

75. Фотобиологические процессы: классификация.

Фотобиологические процессы - процессы, которые начинаются с поглощения квантов света биологически функциональными молекулами и заканчиваются соответствующей физиологической реакцией в организме или тканях. К фотобиологическим процессам относятся: • фотосинтез - синтез органических молекул за счет энергии солнечного света; • фототаксис - движение организмов (например, бактерий) к свету или от света; • фототропизм - поворот листьев (стеблей) растений к свету или от него; • фотопериодизм - регуляция суточных и годовых циклов животных путем циклических воздействий «свет - темнота»; • зрение - восприятие света глазом, сопровождающееся превращением световой энергии в энергию нервного импульса; помутнение хрусталика; • изменения состояния кожи под воздействием света: эритема, эдема, загар, пигментация, ожог, рак кожи.

76. Фотодиструктивные процессы, их общая характеристика. Фотосенсибилизация, её виды и механизм.

К фотодеструктивным процессам относятся инициируемые светом в молекулах биосубстрата реакции, приводящие к образованию таких химических изменений молекулы, которые сопровождаются нарушением или даже полной потерей их функциональных свойств и в конечном счёте обуславливают проявление повреждающих эффектов на клеточном и организменном уровнях. Фотодеструктивные реакции наиболее эффективно индуцируются в биологических системах коротковолновым ультрафиолетовым (УФ) излучением (< 290 нм), что связано с прямым поглощением этого излучения нуклеиновыми кислотами, белками и некоторыми другими биологически важными внутриклеточными компо-нентами.При определенных условиях фотодеструктивные процессы могут протекать и под действием света более длинноволнового диапазона оптического спектра, который подразделяется на три области: средневолновую УФ (290320 нм), длинноволновую УФ (320-400 нм) и видимую (400-700 нм). Длинноволновое УФ-излучение и видимый свет практически не поглощаются нуклеиновыми кислотами и белками. Поэтому инициация в них деструктивных реакций при действии этих видов оптического излучения осуществляется преимущественно с участием других молекул, выступающих в качестве первичных фо-торецепторов. Такие вещества называются фотосенсибилизаторами, а процессы, в которых они участвуют, — фотосенсибилизированными. Известно несколько типов первичных фотохимических превращений молекул, ответственных за деструктивное действие оптического излучения. К ним относятся реакции фотоокисления, фотоионизации, фотодиссоциации и фотоприсоединения. Основной первичной фотореакцией при УФ-фотолизе остатков триптофана (АН) в белках является его фотоионизация с образованием катион- радикала (АН+) и сольватированного электрона (е-s): АН AH+ + е-s. В цистиновых остатках белков первичная фотохимическая реакция заключается в фотодиссоциации S -S-связей: т. е. фотолиз цистина идет через стадию свободных радикалов с локализацией неспаренного электрона на атоме серы. При относительно низких интенсивностях УФ-света основными фотохимическими реакциями, в которые вступают основания нуклеиновых кислот, являются реакции фотоприсоединения — димеризация, гидратация и образование (6-4) пиримидиновых аддуктов. Фотосенсибилизированные деструктивные реакции в большинстве случаев протекают с участием кислорода.

76+++

Эти процессы, получившие название фотодинамических, по своему механизму разделяют на два типа в зависимости от того, каким способом энергия светового возбуждения передается от сенсибилизатора к биологическому субстрату. В реакциях типа I фотовозбужденный сенсибилизатор может вступать в оки-слительно-восстановительные реакции с различными биологически важными моле-кулами, участвуя в переносе электрона либо атома водорода. В результате образуются реакционноспособные радикалы (и/или ион-радикалы) сенсибилизатора и молекул биологического субстрата, вступающие в дальнейшие химические реакции с кислородом. В фотодинамических реакциях типа II происходит перенос энергии от возбу-жденной в триплетное состояние молекулы сенсибилизатора к кислороду с образованием его электронно-возбужденной формы 1О2; образовавшийся синглетный кислород затем окисляет молекулы биологического субстрата. С меньшей эффективностью некоторые триплетные сенсибилизаторы способны осуществлять одноэлектронное восстановление молекулярного кислорода с образованием супероксидного анион-радикала 0-2 Наряду с фотодинамическими деструктивными процессами известны механизмы фотосенсибилизации, не требующие участия кислорода. Такие фотосенсибилизированные реакции, протекающие, в частности, в ДНК, реализуются с участием молекул-сенсибилизаторов, которые либо передают энергию возбуждения на азотистые основания, обеспечивая тем самым их последующую димеризацию, либо в возбужденном состоянии реагируют с мононуклеотидами, образуя аддукты. К пер-вой группе фотосенсибилизаторов относятся некоторые кетоны; вторую группу составляют производные фурокумаринов (псоралены). При фотосенсибилизации с помощью псораленов в ДНК образуются два типа фотопродуктов: (1) моноаддукты (молекула псоралена ковалентно связана с одним пиримидином) и (2) диаддукты, или межнитевые ковалентные сшивки (молекула псоралена ковалентно связана с двумя пиримидинами).