Тема: Окислительное фосфорилирование

ЦЕЛЬ: Понять, что чрезвычайно важной функцией дыхательных катализаторов, связанных с внутренней мембраной митохондрий, наряду с переброской электронов от субстратов дыхания на кислород, является аккумуляция части освобождающейся энергии в фосфатных связях высокоэргических соединений (АТФ).

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ.

1. Макроэргические соединения, характеристика макроэргической химической связи. Биологическая роль этих соединений.

2. Строение митохондрий. Структурная организация цепи переноса электронов и протонов, ферментные комплексы, катализирующие перенос электронов от субстрата на кислород.

3. Разность редокс-потенциалов субстратов и кислорода как источник энергии окислительного фосфорилирования.

4. На каких этапах тканевого дыхания высвобождается энергия, используемая для синтеза АТФ.

5. Коэффициент Р/О, его сущность, величины.

6. Гипотезы синтеза АТФ, их сущность.

7. Специфические ингибиторы ферментов цепи переноса электронов, их использование для идентификации пунктов сопряжения окисления с фосфорилированием.

8. Разобщение дыхания и фосфорилирования, значение данного явления. Разобщающие агенты.

9. Регуляция и нарушение тканевого дыхания и аккумуляция энергии. Дыхательный контроль.

10. Микросомальное окисление, организация цепи переноса электронов, роль цитохрома Р₄₅₀. Биологическое значение этого процесса. Значение пентозофосфатного пути окисления глюкозы для организации работы этой ЦПЭ.

Пользуясь схемой митохондриальной цепи (см. выше) и схемой действия ингибиторов ЦПЭ, ответьте на следующие вопросы:

Ингибирование ферментов ЦПЭ

Ротенон ФАДН₂ Антимицин А

Амобарбитал Карбо- – БАЛ

_ ксин

НАДН-дегидро- QH₂ QH₂-дегидрогеназа

геназа ФМН в с

H₂S, CO, CN^–

–

цитохром С цитохромоксидаза ½ О₂

а а₃

1. Выберите из перечисленных реакций те, которые непосредственно сопряжены с синтезом АТФ:

А. НАДН•Н⁺ + Q НАД⁺ + QH₂

Б. Сукцинат + Q Фумарат + QH₂

В. QH₂ + 2 цит.С (Fe³⁺) Q + 2 цит.С (Fe²⁺) + 2 Н⁺

Г. Изоцитрат + НАД⁺ α -кетоглутарат + НАДН•Н⁺

Д. Малат + НАД⁺ оксалоацетат + НАДН+Н⁺

2. Объясните, почему при отравлении 2, 4-динитрофенолом отмечается у пациентов тяжёлая пирогенная реакция (подъём температуры).

3. Объясните механизм токсического действия на организм барбитуратов, цианидов.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА.

Определение макроэргических соединений скелетных мышц (АТФ и креатинфосфата)

Принцип метода: Метод основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТФ, богатые энергией, так же, как и фосфорный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде – так называемый лабильно связанный фосфор. Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до гидролиза и после гидролиза даёт представление о количестве лабильно связанного фосфора, приходящегося на долю макроэргических соединений. Количество неорганического фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

Порядок выполнения работы.

1. Получение безбелкового экстракта, содержащего АТФ и креатинфосфат. Все процедуры выполняют на холоду, поместив пробирки в стакан со льдом. Растирают 0, 5 г мышцы до получения кашицы, затем переносят её в пробирку с пятью мл охлаждённого 2, 5 % раствора трихлоруксусной кислоты и в течение пяти минут продолжают растирать мышечную кашицу (на холоду!). Затем экстракт фильтруют. Осадок мышечной кашицы на фильтре промывают пятью мл дистиллированной воды. Этот фильтрат объединяют с первым и доводят общий объём до 10 мл дистиллированной водой.

2. Проведение гидролиза. В две пробирки (опыт, контроль) вносят по 0, 5 мл безбелкового фильтрата и по 1 мл раствора соляной кислоты 1Н, в контрольную пробу добавляют равный объём 1Н раствора едкого натра. Опытную пробирку помещают на 10 минут в кипящую водяную баню (гидролиз), затем содержимое пробирки охлаждают и добавляют 1 мл 1Н раствора едкого натра (для нейтрализации кислоты). В обеих пробирках доводят общий объём до 10 мл дистиллированной водой.

3. Определение неорганического фосфора. Из обеих пробирок отбирают по 5 мл жидкости и добавляют 0, 5 мл 1% раствора молибдата аммония, 0, 5 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты и 2 мл воды. Через 10 минут пробы колориметрируют на ФЭКе (длина волны 670 нм) против воды. Находят разность между оптической плотностью опытной пробы и контрольной (соответствует лабильно связанному фосфору). Содержание лабильно связанного фосфора находят по калибровочному графику. Расчёт проводят в мг на 100 г сырой ткани с учётом разведения.

Х = А • 3, 3 • 40 • 100

ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ. Основная:

1. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002, с. 311-314.

2. Биохимия: Учебник/Под ред. Е.С. Северина. –М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003, (Серия XXI век), с. 276-281, 618-621.

3. Николаев А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2001, с. 209-212, 221-223.

4. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В. Биохимия: Учебник. –М.: Медицина, 2000, с. 76-79.

5. Лекционный материал.

Дополнительная литература:

1. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами /Под ред. Члена- корренспондента РАН, проф. Е.С. Северина, проф. А.Я. Николаева. М.: ГЭОТАР-МЕД. 2001. -448 с.: ил. – (XXI век).

2. Марри Р. и соавтор. ‘‘Биохимия человека’’ М.: Мир, 1993, т. 1.

3. Скулачёв Б.П. ‘‘Биоэнергетика. Мембранное преобразование энергии’’, М.: Высшая школа, 1989.