Тема: Методы количественного определения активности ферментов. Основные принципы энзимодиагностики и энзимотерапии.

ЦЕЛЬ: Ознакомиться с принципами выделения ферментов и количественной оценки активности ферментов.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ

1. На регистрации каких явлений основано обнаружение ферментов?

2. На чём основано количественное определение ферментов?

3. Единицы измерения активности ферментов.

4. Различия ферментного состава органов и тканей. Понятие об органоспецифичности ферментов.

5. Принципы и последовательность действий при выделении ферментов из биологического материала.

6. Определение активности ферментов в сыворотке крови и других биологических жидкостях. Изменение активности сывороточных энзимов при заболеваниях. Принципы энзимодиагностики.

7. Основные направления энзимотерапии.

Изоферменты. Клиническое значение определения активности изоферментов на примере лактатдегидрогеназы и креатинфосфокиназы. Решите ситуационные задачи:

1. Поставьте предварительный диагноз по следующим данным анализа крови и мочи больного: активность амилазы, липазы, трипсина в крови и моче больного резко повышена.

2. В приёмное отделение больницы доставлен больной 45 лет с жалобами на острейшие боли в эпигастрии, тошноту, рвоту. При осмотре отмечена бледность кожи и слизистых, аритмичный пульс, снижено АД, аускультативно – глухость сердечных тонов. При лабораторном обследовании: общий анализ крови без воспалительных изменений; биохимический анализ крови – повышение активности АСТ и ЛДГ, при нормальных показателях АЛТ, амилазы, щелочной фосфатазы. Какое заболевание Вы заподозрили? Какие дополнительные ферментные тесты помогут Вам подтвердить диагноз?

3. При исследовании крови больного выявлена величина коэффициента Ритиса (АСТ: АЛТ), равная 0, 46 (в норме – 1, 33). О поражении какого органа свидетельствует выявленный показатель?

Таблица: ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ В МЕДИЦИНЕ

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА.

Количественное определение активности амилазы мочи (диастазы).

Принцип метода: Метод основан на определении времени, необходимого для полного расщепления определённого количества крахмала ферментом, присутствующим в моче. Условно за единицу активности амилазы мочи принимают количество фермента, расщепляющего 2 мг крахмала за 15 минут. Активность амилазы выражают количеством условных единиц в 1 мл мочи. В норме она составляет 1 – 2 ед.

Порядок выполнения работы: На сухую чашку Петри заранее наносят в разных местах по одной капле 0, 1% раствора йода в йодиде калия (всего 10 - 15 капель). В сухую пробирку вносят 2 мл 0, 1% раствора крахмала, содержащего 2 мг крахмала, 1 мл 0, 85% раствора хлорида натрия, перемешивают и помещают пробирку в водяную баню при 37°С на две минуты. Через две минуты, не вынимая пробирку из бани, добавляют в неё 0, 5 мл мочи, перемешивают и отмечают время начала реакции. Затем каждые две – три минуты, не вынимая пробирки из бани стеклянной палочкой переносят каплю смеси из пробирки на чашку Петри в каплю йода. Так продолжают до тех пор, пока окраска капли йода не перестанет

изменяться, т.е. до появления жёлтого цвета, и отмечают время реакции в минутах. Активность амилазы мочи рассчитывают по формуле:

,

где: X – активность амилазы в 1 мл мочи;

15 – время, необходимое для полного расщепления 2 мг крахмала (условная единица) мин.;

0, 5 – количество мочи, взятое в реакционную смесь, мл;

Т – время реакции, мин.

Клинико-диагностическое значение. Гиперамилаземия и гиперамилазурия наиболее выражены при остром панкреатите, хотя отмечаются и при других поражениях этого органа. К гиперамилаземиям внепанкреатического происхождения относят поражение слюнных желёз, почечную недостаточность. При поражениях поджелудочной железы кроме α -амилазы повышается уровень панкреатической липазы, фосфолипазы А₂, трипсина.

ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ. Основная:

1. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002, с. 126-129, 157-159, 163-168.
2. Биохимия: Учебник/Под ред. Е.С. Северина. –М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003, (Серия XXI век), с. 118-123.
3. Николаев А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2001, с. 89-92.
4. Лекционный материал.

Дополнительная литература:

1. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами /Под ред. Члена-корренспондента РАН, проф. Е.С. Северина, проф. А.Я. Николаева. М.: ГЭОТАР-МЕД. 2001. -448 с.: ил. – (XXI век).
2. Бородин Е.А. ‘‘Биохимический диагноз’’, часть 1, Благовещенск, 1991.
3. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. ‘‘Биохимия для врача’’, Екатеринбург, 1994.
4. Клиническая биохимия /Под ред. В.А. Ткачука –М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002. -360 с. –(Серия XXI век)
5. Клиническая биохимия /Пер. с англ. –М. –СПб.: «Издательство Бином» - «Невский Диалект» 1999. -368 с., ил.
6. Марри Р. и соавтор. ‘‘Биохимия человека’’ М.: Мир, 1993, т. 1.