Тема: Химическая природа и свойства ферментов.

ЦЕЛЬ: Изучить химическую природу ферментов, отличия ферментативного катализа, специфичность и термолабильность ферментов. Устанавливать принадлежность ферментов к определённому классу, назвать ферменты, исходя из класса и субстрата или продукта реакции.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ

1. Определение понятия ‘‘фермент’’. История изучения ферментов.

2. Биологическая роль ферментов. Отличия ферментов от небиологических катализаторов (высокая каталитическая активность, специфичность, регулируемость).

3. Химическая природа ферментов, их строение. Активный и аллостерический центры, их роль в обеспечении активности и специфичности ферментов.

4. Механизм действия ферментов. Стадии ферментативного катализа. Роль конформационных изменений фермента при катализе.

5. Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры, рН, концентрации субстрата и фермента.

6. Ферменты простые и сложные. Кофакторы. Апо- и коферменты. Коферментные функции витаминов (В₁, В₂, В₃, РР, В₆, В_С, Н).

7. Классификация и номенклатура ферментов. Ключ к нумерации ферментов.

Решите следующие задачи:

1. Фермент сахараза может катализировать следующие реакции:

1. Сахароза + Н₂О глюкоза + фруктоза

2. Рафиноза + Н₂О фруктоза + галактоза

Если субстратом является сахароза, то К_м= 0, 05 мМ, если рафиноза, то К_м=2, 0 мМ. В каком случае при одинаковой концентрации субстратов скорость реакции будет больше?

2. Изобразите в виде графиков зависимость скорости реакции, катализируемой гексокиназой, от концентрации субстратов – глюкозы (К_м= 0, 04) и фруктозы (К_м= 1, 5), если считать максимальную скорость одинаковой (10 мМ в мин).

Гексоза + АТФ ^{гексокиназа} гексозо-6-фосфат + АДФ

В каком случае при одинаковой концентрации субстратов, например 0, 1 мМ, скорость реакции будет больше?

3. В схеме ферментативной реакции римскими цифрами обозначены основные этапы ферментативного катализа:

E + S ^I ES ^II ES^{X III} P + E

На каких из этих стадий происходит: а) перераспределение электронной плотности в химических связях субстрата; б) увеличивается комплементарность между субстратом и активным центром фермента; в) образование новых химических связей в молекулах, превращаемых под действием фермента?

4. По изменению концентрации каких веществ можно измерить скорость реакций, катализируемых протеолитическими ферментами? Какие цветные реакции можно использовать для доказательства?

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ

Свойства ферментов будут изучаться на примере амилазы слюны, фермента, гидролизирующего гликозидные связи в молекуле крахмала.

I. Специфичность ферментов.

Принцип метода: субстраты (крахмал и сахароза) не обладают восстанавливающими свойствами и не дают реакцию Троммера. Продукты же их гидролиза обладают восстанавливающими свойствами, и с ними реакция Троммера положительна.

Порядок выполнения работы: В две пробирки вносят по 5 капель слюны (1: 10). В первую пробирку добавляют 10 капель 1% раствора крахмала, во вторую – 10 капель 1% раствора сахарозы. Обе пробирки инкубируют при 37°С в течение 10 минут. После инкубации с содержимым обеих пробирок проделывают реакцию Троммера.

Реакция Троммера: К 10 каплям исследуемой жидкости добавляют 10 капель 10% раствора гидроксида натрия и 5 капель 1% раствора сернокислой меди. Осторожно нагревают верхнюю часть содержимого пробирки и кипятят в течение 1 минуты. Появление кирпично-красного осадка при кипячении указывает на наличие восстанавливающих свойств у веществ, находящихся в исследуемом растворе. В данном случае появление мальтозы, глюкозы.

На основании регистрации результатов реакции Троммера с содержимым той и другой пробирки сделайте вывод о специфичности фермента амилазы.

II. Влияние температуры на активность амилазы слюны.

Порядок выполнения работы: В 4 пробирки наливают по 0, 5 мл 1% раствора крахмала, ещё в 4 пробирки – по 0, 5 мл разбавленной 1: 10 слюны. Каждую пару пробирок (одна с ферментом – амилазой слюны, другая с субстратом – крахмалом) помещают в условия различного температурного режима на 5 минут – в лёд (0°С), кипящую водяную баню (100°С), термостат (40°С), четвёртую пару оставляют при комнатной температуре. Через 5 минут содержимое пробирок каждой пары сливают вместе, перемешивают и оставляют на 10 минут в тех же условиях. Если через 10 минут проба на предметном стекле содержимого пробирки из термостата с йодом даст жёлтое окрашивание, то во все пробирки добавляют по 10 капель 1% раствора йода. Если окрашивание пробы из термостата синее или кирпично-красное, то инкубацию продляют до появления жёлтого окрашивания.

Оформление работы:

Сделайте вывод об оптимуме температуры для амилазы слюны.

III. Влияние рН на активность амилазы слюны.

Порядок выполнения работы: Берут 8 пробирок, в каждую из них вносят по 2 мл фосфатного буфера с различными значениями рН (от 5, 4 до 8, 0), 1 мл 1% раствора крахмала и по 0, 5 мл раствора слюны (1: 10). Через 10 минут берут по 1 капле жидкости из каждой пробирки на предметное стекло и смешивают с раствором йода. Повторяют эту процедуру каждые 1 – 2 минуты до появления в одной из пробирок жёлтого окрашивания. Затем во все пробирки добавляют по 2 – 3 капли раствора йода.

Оформление работы:

Делается вывод об оптимуме рН для амилазы слюны.

ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ. Основная:

1. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002, с. 114-126, 129-145, 159-163.
2. Биохимия: Учебник/Под ред. Е.С. Северина. –М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003, (Серия XXI век), с. 76-102.
3. Николаев А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2001, с. 53-78, 81-84.
4. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В. Биохимия: Учебник. –М.: Медицина, 2000, с. 17-22.
5. Лекционный материал.

Дополнительная литература:

1. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами /Под ред. Члена-корренспондента РАН, проф. Е.С. Северина, проф. А.Я. Николаева. М.: ГЭОТАР-МЕД. 2001. -448 с.: ил. – (XXI век).
2. Клиническая биохимия /Под ред. В.А. Ткачука –М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002. -360 с. –(Серия XXI век)
3. Клиническая биохимия /Пер. с англ. –М. –СПб.: «Издательство Бином» - «Невский Диалект» 1999. -368 с., ил.
4. Марри Р. и соавтор. ‘‘Биохимия человека’’ М.: Мир, 1993, т. 1.