Культуральные и биохимические свойства возбудителей пищевых токсикоинфекции

Бактерии группы Salmonella обладают избирательными сахаролитическими свойствами, кроме того, выделяют сероводород, а отдельные штаммы способны разжижать желатин.

Бактерии группы Е. coli обладают преимущественно сахаролитическими свойствами, поэтому при росте на элективных средах, трехсахарном агаре и средах Гиса они расщепляют сахара, вызывая сме­щения рН среды в кислую сторону, что приводит к изменению цветаиндикатора.

Бактерии группы Proteus активно размножаются во внешней среде и продуктах питания при рН от 3, 5 до 12, выдерживают нагревание до 65°С в течение 30 мин, характеризуются устойчивостью к поваренной соли и высыханию. Бактерии группы Proteus на агаре и большинстве твердых сред растут «ползучим» ростом, расщепляют желатин, фер­ментируют мочевину, выделяют протеолитические ферменты, не­которые штаммы выделяют сероводород, фенол, аммиак и индол, большинство -сахаров не расщепляют. Основные биохимические свойства возбудителей пищевых токсикоинфекции представлены в табл. 11.

Таблица 11.

Биохимические свойства возбудителей пищевых токсикоинфекций

Для изучения культуральных и биохимических свойств возбудите­лей пищевых токсикоинфекции вторичные посевы делают на трехсахарный агар и среды короткого пестрого ряда.

Трехсахарный агар

Трехсахарный агар с индикатором «ВР» (Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука)

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 2 г глюкозы* 1| г саха­розы, IS г лактозы, 0, 6 г соли Мора, I г серноаатистокислого натрия и

10 г мочевины. Соль Мора и серноватистокислый натрий предвари­тельно растворяют в 5-7 мл дистиллированной воды в пробирках. Уг­леводы и мочевину также растворяют в 10 мл дистиллированной воды в колбе на водяной бане. До стерилизации устанавливают рН 7, 4-7, 6 и добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором «ВР» (смесь розоловой кислоты и метиле нового синего в равных пропорциях). Раствор размешивают и кипятят до расплавления агара, разливают в пробирки по 5—6 мл в каждую. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин или при температуре 112° С в течение 20 мин. После стерилизации среду скашивают так, чтобы остался не­большой столбик (не менее 3 см). Среда янтарного цвета с красно­ватым оттенком.

Трехсахарный агар с мочевиной (по Олькеницкому)

К 100 мл стерильного питательного агара добавляют 1 г лактозы, 0, 02 г соли Мора, 0, 03 г гипосульфита натрия, 1 г сахарозы, 0, 1 г глюкозы, 1 г мочевины и 1 мл 0, 4 % раствора фенолового красного.

Предварительно растворяют соль Мора с гипосульфитом в одной пробирке с небольшим количеством воды, а в другой — мочевину с угле­водами. После растворения все смешивают с агаром и фильтруют через стерильную марлю. Разливают по пробиркам по 5—6 мл. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. Среда имеет бледно-розовый цвет.

Методика посева возбудителей

пищевых токсикоинфекции на трехсахарный агар

Готовят взвесь микробных клеток в изотоническом 0, 9 % растворе хлористого натрия с концентрацией 2—3 млн микробных клеток. Для этого берут пробирку с 5 мл стерильного изотонического рас­твора и вносят в нее профламбированной петлей кусочек исследу­емой колонии микроорганизмов и тщательно перемешивают. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока жидкость в пробирке не станет опалесцировать. Затем распрямляют бактериологическую петлю, опускают ее в приготовленную взвесь и делают увкол на всю глубину трехсахарного агара. Затем бактериологическую петлю флам-бируют, остужают, повторно опускают во взвесь бактерий и делают посев штрихом на скосе.

Учет роста возбудителей пищевых токсикоинфекции на трехсахарном агаре

После инкубации при температуре 37°С в течение 24 часов проводят учет роста возбудителей (см. табл. 12, 13).

Таблица 12. Рост возбудителей пищевых токсикоинфекции на трехсахарном агаре с индикатором «ВР»

Таблица 13. Рост возбудителей пищевых токсикоинфекции на трехсахарном агаре (по Олькеницкому)

Среды короткого и длинного пестрого ряда

Короткий пестрый ряд используется для изучения биохимических свойств возбудителей пищевых токсикоинфекции и определения рода бактерий.

Короткий пестрый ряд представляет собой набор сред, разлитых в пробирки: скошенный МПА, бульон Хоттингера, МПЖ, среды Гисса с сахарами (лактоза, глюкоза, сахароза и маннит). В бульон Хоттинге­ра под пробку помещают индикаторную бумажку, пропитанную уксус-нокислым свинцом (для определения сероводорода), а в среду Гис­са с глюкозой помещают газовичок для определения углекислого газа.

Длинный пестрый ряд используется для типизации возбудителей пищевых токсикоинфекции. Длинный пестрый ряд состоит из сред короткого пестрого ряда и дополнительных сред Гисса со следующи­ми сахарами: арабинозой, дульцитом, инозитом, рамнозой, «бульоном Штерна», трегалозой, ксилозой и др.

Бульон Хоттингера

К 100 мл основного раствора Хоттингера (мясной бульон 1: 2, гид-ролизованный панкреатином) добавляют 500 мл водопроводной воды, 3 г хлорида натрия и 0, 12 г двузамещенного фосфорнокислого калия. Полученный раствор кипятят в течение 10 мин, фильтруют, устанавливают рН 7, 2—7, 4 и стерилизуют в течение 20 мин при тем­пературе 120° С.

Бульон Хоттингера используется для определения сероводорода и индола.

Приготовление индикаторной бумаги для определения сероводорода. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 20 г уксуснокислого свинца и I г двууглекислого натрия. Этим раствором пропитывают полоски фильтровальной бумаги, высушивают их при температуре 18—23°С и нарезают на узкие полоски. После приготовления бумага остается белой; при наличии сероводорода — буреет и чернеет.

Для определения индола ставят реакцию с реактивом Эрлиха.

Приготовление реактива Эрлиха. 5 г парад иметилам идобен зал ьдеги-да, 10 мл очищенной концентрированной фосфорной кислоты раство­ряют в 50 мл 96 % спирта.

В пробирку с бульоном Хоттингера добавляют 2—3 мл эфира и 1 мл реактива Эрлиха. При этом реактив Эрлиха и индол скапливаются на границе эфира и бульона и, вступая в реакцию, образуют кольцо розо­вого цвета.

Пептонно-углеводные среды (среды Гисса)

К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 1 г сухого фермента­тивного пептона, 0, 5 г хлористого натрия и нагревают до растворения, затем фильтруют до тех пор, пока раствор не станет совершенно про­зрачным. Устанавливают рН 7, 0, прибавляют 0, 5 г углевода и 1 мл ин­дикатора Андреде.

Среду разливают по 5 мл в пробирки с поплавками и стерилизуют 20 мин при температуре 100°С. Среда должна быть бесцветной или со­ломенно-желтого цвета без розового оттенка. Можно использовать го­товые среды Гисса.

Для приготовления индикатора Андреде к 100 мл дистиллированной воды добавляют 16, 4 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия и 0, 5 г кис­лого фуксина. Раствор стерилизуют 5 мин при температуре 110-112°С. И ндикатор хранят в склянке из темного стекла.

Бульон Штерна

К 100 мл мясопептонного бульона добавляют 5 капель насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 1 мл глицерина и 2 мл свеже­приготовленного 10% раствора сернокислого натрия. Среду разливают по пробиркам, стерилизуют при температуре 110°С 10-15 мин. Среда — золотисто-желтого цвета.

Методика посева на среды короткого и длинного пестрого ряда

Посев на среды короткого и длинного пестрого ряда проводят взвесью микробных клеток (приготовление взвеси см. выше — посев на трехса­харный агар). Для посева на скошеннный МПА бактериологическую петлю фламбируют, остужают, опускают во взвесь бактерий и делают посев штрихом на скосе. На все остальные среды посев делают при по­мощи пастеровской пипетки. Запаянный конец стерильной пастеров­ской пипетки обламывают над пламенем газовой горелки, после чего пипетку заполняют взвесью микробных клеток. Пробирку со средой осторожно приоткрывают над пламенем газовой горелки и капают в нее каплю взвеси, после чего пробирку быстро закрывают. После по­сева конец пастеровской пипетки запаивают над пламенем газовой горелке, а саму пипетку помещают в емкость с дезинфекционным рас­твором. Штатив со средами

короткого или длинного пестрого ряда по­мещают на 24 часа в термостат с температурой 37°С

Занятие 3. Биохимическая и серологическая типизация возбудителей пищевых токсикоинфекций

Цель занятия: изучить основные серотипы сальмонелл и обосновать необходимость их типизации, отработать методики биохимической

и серологической типизации сальмонелл. План работы:

1. Определить род возбудителей пишевых токсикоинфекций путем изучения посевов на средах короткого пестрого ряда и на трех-

сахарном агаре.

2. Рассмотреть основные серотипы сальмонелл и обосновать необ­ходимость их типизации.

3. Провести биохимическую типизацию возбудителей сальмонелл путем изучения посевов на средах длинного пестрого ряда.

4. Провести серологическую типизацию сальмонелл при помощи агглютинирующих сальмонеллезных сывороток.

5. Рассмотреть ветеринарно-санитарную оценку возбудителей пи­щевых токсикоинфекций.

Материальное обеспечение: среды с посевами, сделанными студента­ми на предыдущем занятии, пробирки (10 шт.), пипетки, предметные стекла, бактериологическая петля, бактериологический мостик, про-стоквашница, газовая горелка (спиртовка), наборы диагностических агглютинирующих сальмонеллезных сывороток комплексных и моно-рецепторных, таблицы: «Рост возбудителей пищевых, токсикоинфек­иий на длинном пестром ряде», «Схема серологической типизации сальмонелл», «Состав первого набора диагностических сальмонеллез­ных сывороток», вода дистиллированная, раствор для дезинфекции рук, спирт этиловый.

Основные серотипы сальмонелл и их практическое значение

В настоящее время известно более 2300 серотипов сальмонелл. На­иболее патогенными являются следующие: для человека и многих видов домашних животных — S. typhi murium; для крупного рогатого скота — 5. Dublin, S. enteritidis; для свиней — S. cholerae suis, S. typhi sttis; для птиц — S. gal Una rum, S. pullorum. Все вышеперечисленные се­ротипы сальмонелл являются для человека патогенными или условно патогенными. Сальмонеллы обладают высокой устойчивостью к тер­мической обработке и в течение длительного времени могут сохра­няться в мясе и других продуктах. Кроме того, следует отметить, что бактерии рода Salmonella обладают преимущественно сахаролити-ческими свойствами и практически не выделяют протсолитических ферментов, поэтому при органолептическом исследовании заражен­ных продуктов обычно не обнаруживают видимых изменений. Эти свойства сальмонелл способствуют широкой распространенности данной пищевой токсикоинфекций.

Значение типизации сальмонелл и других возбудителей пищевых токсикоинфекций

Типизация возбудителей пищевых токсикоинфекций необходима для того, чтобы установить патогенность данного возбудителя для человека и других видов животных; для выявления источника пищевой токси­коинфекций; для разработки оптимальных способов лечения пищевых токсикоинфекций и подбора наиболее эффективных антибиотиков и лечебных сывороток; для профилактики сальмонеллезов и колибак-териозов в хозяйствах и оптимального подбора вакцин и сывороток.

Биохимическая типизация возбудителей пищевых токсикоинфекций по средам длинного пестрого ряда

Биохимическая типизация основана на различии у сальмонелл опре­деленных ферментов. В силу ферментных различий одни бактерии

способны разлагать те или иные углеводы или спирты, а другие такой способностью не обладают.

При биохимической типизации применяют среды длинного пестро­го ряда. Для этого необходимо произвести учет роста возбудителей пищевых токсикоинфекций на длинном пестром ряде. Если исследу­емый возбудитель расщепляет какой-то конкретный сахар, то при его распаде выделяются различные кислоты, рН среды Гисса становится кислой, и индикатор Андреде окрашивает среду в красный цвет. Если сахар не расщепляется, то среда остается желтой, и реакция считается отрицательной. После учета реакции полученные результаты сравни­вают с биохимическими свойствами возбудителей пищевых токсико­инфекций (см. табл. 14) и методом исключения выявляют конкретный серотип бактерии.

Если по результатам проведенного исследования оказалось, что два или несколько серотипов сальмонелл обладают одинаковыми биохимически­ми свойствами, то для типизации возбудителя можно воспользоваться одним из следующих способов: удлинить пестрый ряд (сделать пересев на среды Шса с теми сахарами, которые по-разному расщепляются срав­ниваемыми оеротипами сальмонелл); провести серологические реакции с монорецепторными сыворотками, реагирующими со сравниваемыми серот и нам и сальмонелл. Установлению серотипа сальмонелл может спо­собствовать логический анализ (эпизоотическое состояние населенного пункту тсографшг гхклростгххненносга сравниваемых серотипов, их па-тогснностъжя данного вила животных).

Антигенная структура сальмонелл

Бактерии рода сальмонелл имеют сложную антигенную структуру. По­давляющее большинство серотипов сальмонелл имеют два вила анти­генов: термостабильный О-антиген (соматический), связанный с телом бактерий, и термолабильный Н-антиген (жгутиковый), связанный с двига­тельным аппаратом бактерий. Оба антигена имеют сложную структуру Так О-антиген состоит из двух и более рецепторов, обозначаемых араб­скими цифрами. Жгутиковый антиген

подразделен на две фазы: 1-ю специфическую и 2-ю неспецифическую. Антигены 1-й специфической фазы условно обозначаются малыми буквами латинского алфавита, а 2-й неспецифической — арабскими цифрами и частично малыми бук­вами латинского алфавита. У некоторых сальмонелл Н-антиген отсутс­твует полностью (S. Pulorum, S. Gallinarum), у других же отсутствует только неспецифическая фаза или специфическая фаза Н-антигена. О преимущес­твенной активности той или иной фазы антигена можно косвенно судия по внешнему виду колоний на МПА. Если колонии гладкие, блестящие с ровными краями, то более активной яыяется специфическая фаза Н-антигена. Если колонии шероховатые, матовые, с неровными краями, то более активна неспецифическая фаза Н-ангигена.

Серологическая типизация сальмонелл

Как известно, по серологической типизации насчитывается более 2000 серотипов сальмонелл. Они обитают в организме животных мно­гих видов и человека, а также во внешней среде.

Вместе с общностью морфологических и культуральных свойств бактерии рода сальмонелла отличаются друг от друга по антигенным свойствам. Эти различия и положены в основу метода их серологиче­ской типизации.

По различию в строении О-актмгенов у отдельных видов сальмо­нелл Кауфман и Уайт разделили бактерии этого рода на несколько се­рологических групп, которые обозначаются заглавными буквами ла­тинского алфавита иногда в сочетании с арабскими цифрами — А, В, С_р D, Е, и т. д. Все сальмонеллы* относящиеся к одной группе, имеют один или несколько обших рецепторов 0*антигена. Поэтому сероло­гическая типизация сальмонелл осуществляется в два этапа. Вначале по наличию определенного рецептора О-аитигена определяют группу, затем внутри группы по наличию определенных Н-аитигенов опреде­ляют серотип сальмонеллы.

Лабораторное занятие 4

Задание: