![]() Главная страница Случайная страница КАТЕГОРИИ: АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника |
Лабораторное занятие 4
Задание: определить бактериальную обсеменённость молока. Приборы и реактивы: стерильные пробирки, пробы молока, редуктазник, рабочий раствор метиленовой сини, 0, 005% раствор резазурина, резиновые пробки. 1. Проба на редуктазу с метиленовой синью. ГОСТ 9225-84 Сущность метода основана на определении биохимической активности микробов, продуцирующих фермент редуктазу. Редуктаза обладает способностью обесцвечивать некоторые краски, в частности метиленовую синь. Однако не все микроорганизмы обладают восстановительной активностью. В большей степени этим свойством обладают молочнокислые стрептококки, кишечная палочка, масляно-кислые и гнилостные бактерии. Несколько меньше – сальмонеллы и стафилококки, а патогенные стрептококки лишены этой способности. Приготовление основного спиртового раствора метиленовой сини. 10 г метиленовой сини залить 100 cм3 спирта и оставить в термостате на сутки при 37°С. Профильтровать. Стандартный рабочий раствор готовят из основного: к 5 cм3 этого раствора прибавить 195 cм3 дистиллированной воды. Техника определения: 1. В чистую пробирку налить 1 cм3 рабочего раствора метиленовой сини и 20 cм3 исследуемого молока, закрыть пробкой и хорошо перемешать. 2. Пробирку с молоком поместить в редуктазник с температурой воды 38-40°С уровень воды в редуктазнике должен быть выше уровня молока в пробирке, необходимо постоянно поддерживать температуру воды 3. Проверять время обесцвечивания проб через 40 минут, 2, 5 часа и через 3, 5 часа. Окончанием испытания на редуктазу считать момент, когда молоко в пробирках обесцветиться. Наличие небольшого окрашенного кольцеобразного слоя наверху или окраска небольшой части внизу в расчёт не принимаются. Молоко по количеству микрофлоры делят на 4 класса. Таблица 10.
Определение класса бактериальной загрязнённости молока (с метиленовой синью)
2. Проба на редуктазу с резазурином. Готовят основной раствор резазурина: 10 мг резазурина растворяют в 200 cм3 дистиллированной воды и хранят в холодильнике до 30 суток при температуре 3-50С. Рабочий раствор готовят, разбавляя основной раствор дистиллированной водой в соотношении 1: 10, он содержит 0, 005% резазурина. Техника определения: В чистую пробирку отмеривают 10 cм3 молока, добавляют 1 cм3 0, 005%-ного рабочего раствора резазурина. Пробирку закрывают пробкой, осторожно перемешивают содержимое, ставят на водяную баню при температуре 37°С±1°С и в течение 1 и 1, 5 часа наблюдают за изменением окраски. Интенсивность окраски содержимого пробирки определяют путём сравнения с данными таблицы №11.
Таблица 11. Количество бактерий в молоке и его класс по редуктазной пробе с резазурином
Факторы, влияющие на точность определения: 1. Неправильно приготовленный раствор метиленовой сини или резазурина 2. Низкая температура в водяной бане 3. Грязные пробирки 4. Неплотно закрытые пробирки
Выполнить самостоятельно: 1. Определить бактериальную обсеменённость молока с метиленовой синью и резазурином
Лабораторное занятие 7
Задание: Освоить методы контроля натуральности и пастеризации молока. Приборы и реактивы: Пробы молока, пробирки, пипетки на 5, 2, 1 cм3, цилиндры на 250 cм3, молочный ареометр, 0, 2%-ный спиртовой раствор розоловой кислоты; 0, 04%-ный раствор бромтимолового синего, реактив Несслера, 3-4%-ная настойка йода, йодисто-калиевый крахмал, 10%-ный раствор уксусной кислоты, фенолфталеинфосфат натрия. Молоко считается фальсифицированным, если к нему добавлены посторонние вещества или снят жир. Различают характер фальсификации, т.е. что добавлено к молоку, и степень фальсификации молока – количество добавленных посторонних веществ. Для определения характера и степени фальсификации молока необходимо знать в исследуемой и стойловой пробах содержание жира, сухого вещества и СОМО, плотность молока. Фальсификация водой. При добавлении в молоко воды снижается содержание сухого вещества, СОМО, жира, а также плотность и кислотность. Степень фальсификации рассчитывают по формуле: В=(СОМО - СОМО1)/СОМО *100 или В= (Д-Д1)/Д * 100; Где: В – количество воды, добавленной к молоку, % СОМО – показатель стойловой пробы, % СОМО1 – показатель исследуемой пробы, % Д – плотность молока стойловой пробы (°А) Д1 – плотность молока исследуемой пробы (°А) Установлено, что добавление в молоко 10% воды снижает плотность на 3°А. Фальсификация молока обезжиренным молоком или снятием сливок. При добавлении обезжиренного молока или снятии сливок плотность повышается, содержание сухого вещества и жира снижается, СОМО не изменяется или слегка повышается. Степень фальсификации рассчитывают по формуле: О = (Ж –Ж1)/Ж * 100, Где: О – количество добавленного обезжиренного молока, % Ж – количество жира в стойловой пробе, % Ж1 – количество жира в исследуемой пробе, % Для большей достоверности при установлении характера фальсификации в случае добавления обезжиренного молока производят расчёт по формуле: Жсв=Ж1/С1 * 100, Где: Жсв – содержание жира в сухом веществе молока, % С1 – содержание сухого вещества в молоке исследуемой пробы, % Наличие в сухом веществе молока менее 25% жира указывает на то, что к нему добавлено обезжиренное молоко или сняты сливки. Двойная фальсификация. При одновременном добавлении к молоку воды и обезжиренного молока содержание сухого вещества, СОМО, и жира снижается, а плотность не изменяется. Степень фальсификации определяют по формулам: Д= 100 – (Ж1/Ж * 100); В = 100 – (СОМО1/СОМО * 100); О= Д – В; Где: Д – количество воды и обезжиренного молока, %
Пример. При исследовании проб молока получены такие результаты:
Д=100 – (2, 0/3, 8 * 100)= 47, 4% В=100 – (8, 31/9, 02 * 100)=8%; О=47, 4 – 8=39, 4% При фальсификации молока с добавлением воды или подснятием сливок, в молоке возникают следующие изменения. Таблица 15. Изменения в молоке при фальсификации
1.Определение в молоке соды (ГОСТ 24065-80) Для снижения кислотности (раскисления) молока к нему добавляют питьевую соду. При фальсификации повышается pH молока и возникает нейтральная или щелочная реакция. Это можно установить с помощью индикаторов: А) проба с бромтимоловым синим В пробирку налейте 5 cм3 испытуемого молока и осторожно по стенке добавьте 7-8 капель раствора бромтимолового синего. Через 10 минут наблюдайте за изменением окраски кольцевого слоя. При отсутствии соды кольцевой слой имеет жёлтую окраску, при добавлении соды - зеленую. Этим методом можно обнаружить содержание соды до 0, 05%. Б) проба с розоловой кислотой. В пробирку вносят равные объемы молока и 0, 2%-ный раствор розоловой кислоты. В присутствии соды молоко окрашивается в малиновый цвет, без соды - в оранжевый. 2.Определение в молоке крахмала Для увеличения вязкости молока (его густоты) к нему добавляют крахмал или муку. В пробирке смешайте 5 cм3 молока и 3 капли настойки йода или люголевского раствора. При наличии крахмала молоко окрашивается в синий цвет, а при его отсутствии в бледно-желтый. 3.Определение в молоке формалина Формалин добавляют в молоко как консервирующее вещество. В пробирку отмерьте 2 cм3 смеси серной кислоты с азотной и по стенке добавьте 2 cм3 молока. При наличии формалина на границе соприкасающихся жидкостей образуется фиолетовое кольцо, а при отсутствии- жёлтое. 4. Определение в молоке перекиси водорода (ГОСТ 24067-80) Перекись водорода добавляют в молоко для его консервации. В пробирку отмерьте 1 cм3 молока, прибавьте 4 капли йодисто-калиевого крахмала, размешайте и прибавьте 1 каплю серной кислоты. При наличии перекиси водорода в молоке появляется синий цвет, а при отсутствии – цвет не изменяется. 5. Определение в молоке аммиака (ГОСТ24066-80) Метод позволяет установить содержание аммиака до 6-9мг%. А) В стакане отмерьте 20 cм3 молока и нагрейте в течение 2-3 мин на водяной бане при 40-45°С, затем внесите 1 cм3 10%-ного раствора уксусной кислоты и оставьте в покое на 10 минут (для осаждения казеина) Б) В пробирку отберите пипеткой через вату 2 cм3 отстоявшейся сыворотки и добавьте к ней 1 cм3 реактива Несслера. Содержимое пробирки перемешайте и в течение 1 мин наблюдайте. Появление лимонно-жёлтого окрашивания указывает на наличие аммиака в норме, оранжевая окраска указывает на содержание аммиака выше нормы. Контроль пастеризации молока. В практике часто возникает необходимость контроля проведения пастеризации молока и её эффективности. При нагревании (пастеризации) молока в нём разрушаются ферменты, в том числе пероксидаза и фосфатаза. Наличие этих ферментов в молоке указывает на отсутствие пастеризации или нарушение режима пастеризации. А) Проба на фосфатазу Метод основан на гидролизе фенолфталеинфосфата натрия ферментом фосфатазой. Освобождающийся фенолфталеин в щелочной среде дает розовое окрашивание. В пробирку налейте 2 cм3 молока и 1 cм3 рабочего раствора фенолфталеинафосфата натрия, перемешайте и поставьте на 1 час в водяную баню 40-45°С не пастеризованное молоко или молоко с нарушенным режимом пастеризации окрашивается в розовый цвет. Пастеризованное молоко остаётся белым. Б) Проба на пероксидазу Метод основан на разложении перекиси водорода ферментом пероксидазой. Освободившийся кислород окисляет йодистый калий, освободившийся йод образуют с крахмалом соединение синего цвета. Пероксидаза разрушается при нагревании молока до 75°С и выше. В пробирку налейте 5 cм3 молока, 5 капель раствора йодисто-калиевого крахмала и 5 капель 0, 05%-ного раствора перекиси водорода, содержимое перемешайте. Не пастеризованное молоко окрашивается в синий цвет, пастеризованное остаётся белым. В) Лактоальбуминовая проба Основана на свойстве альбуминовой фракции белка свёртываться при нагревании выше 80°С. В колбочку возьмите 5 cм3 молока, 20 cм3 воды и 3 cм3 0, 1 н раствора серной кислоты. Осадок казеина отфильтровать, в пробирку налейте 5 мл фильтрата и прокипятите. Хлопьев нет – молоко пастеризованное при температуре выше 80°С. при наличии хлопьев – молоко сырое или пастеризованное при низких температурах. Выполнить самостоятельно: 1. Определить наличие посторонних примесей в молоке 2. Результаты анализа занести в таблицу 16
Таблица 16. Наличие посторонних примесей.
Лабораторное занятие 8
Задание: 1. Освоить методы определения молока, полученного от больных коров. 2. Освоить методы установления примеси анормального молока в сборном. 3. Освоить метод выявления в молоке антибиотиков. Приборы и реактивы: Молочно-контрольная пластинка, уленгутовские пробирки, стеклянные палочки, 5%-ный раствор димастина, 4%-ный раствор едкого натра, 2, 5%-ный раствор препарата «Мастоприм», реактив Росса, бруцеллёзный антиген, маститопроб, маститодиагност, вискозиметр ВМЛК. Мастит – воспаление молочной железы. Лабораторная диагностика маститов основана на выявлении физико-химических изменений молока, увеличении в нём количества соматических клеток (лейкоциты, эпителиальные клетки) и выделении возбудителя. Молоко от здоровых коров в среднем периоде лактации имеет слабокислую реакцию (pH6, 3-6, 9). При заболевании коров маститом реакция молока в большинстве случаев становиться щелочной (pH 7, 0 и выше). Молоко, полученное от животных, больных маститом, можно обнаружить с помощью постановки проб с мастидином, димастином, маститодиагностом, маститопробом, пробой Уайтсайда и при помощи специальных приборов. А) Проба с димастином Реактив димастин состоит из сульфанола, гипосульфита натрия, глауберовой соли, фенолово - красного индикатора. Для исследований готовят 5%-ный раствор на дистиллированной воде. Техника определения: В каждое углубление пластинки МКП-1 из соответствующей четверти вымени надаивают по 1 cм3 молока и добавляют 1 cм3 приготовленного раствора димастина. Смесь молока с реактивом перемешивают в каждой луночке в течение 10-15 сек.
Реакцию учитывают по консистенции сгустка и цвета смеси: - реакция отрицательная - однородная жидкость оранжевого, оранжево-красного цвета, pH 6, 5-6, 8 - реакция сомнительная – следы образования желе, цвет красный, pH 6, 8-7, 0 - реакция положительная – ясно видимый плотный сгусток алого или пунцового цвета, pH выше 7, 0 Б) Проба с 10%-ным раствором мастидина. Техника постановки аналогична, как с 5%-ным раствором димастина. - реакция отрицательная – однородная жидкость светло – сиреневого (дымчатого) цвета; - реакция сомнительная – следы образования желе, почти белого цвета; - реакция положительная – ясно видимый плотный сгусток, тёмно – сиреневого цвета. В) Проба с маститодиагностом. Маститодиагност представляет собой смесь сульфанола, триполифосфата натрия, водорастворимого бромтимолового синего и розоловой кислоты. В сухом виде индикатор сохраняет активность в течение 5 лет, а в растворе при температуре 3-5°С – до трёх лет. Индикатор готовят следующим образом: в 1 л дистиллированной воды, подогретой до 70-76°С, растворяют 50г триполифосфата натрия и 300г порошкообразного сульфанола. Когда смесь раствориться и раствор остынет до температуры 20-25 °С, добавляют 0, 2г водорастворимого бромтимолового синего и 5 cм3 1%-ного спиртово-водного раствора розоловой кислоты. После взбалтывания индикатор готов к употреблению. Техника определения. В молочно-контрольную пластину или в пробирку наливают 1 cм3 маститодиагноста и 1 cм3 молока, перемешивают 3-5 сек. Учёт реакции проводят по таблице 17. Таблица 17. Учёт реакции с индикатором маститодиагностом
Г) Исследование молока с маститопробом. Маститопроб изготовляют из стирального порошка «Лотос». Для приготовления индикатора 300г порошка «Лотос» растворяют в 1, 5 л горячей воды. Для лучшего растворения смесь подогревают до кипения (кипятят около 1 мин), отстаивают 3-4 часа, затем отстоявшуюся жидкость фильтруют, а осадок выбрасывают. Полученный индикатор не теряет активности в течение 3-5 лет. Техника определения. В молочно-контрольную пластину наливают 1 cм3 маститопроба и 1 cм3 молока. Учёт реакции через несколько секунд. При положительной реакции образуется слизистая масса или желеобразный сгусток, сомнительная – наличие единичных слизистых нитей, отрицательная – гомогенная жидкая смесь. Д) Проба Уайтсайда. Для постановки реакции используют 4 % раствор едкого натра. Техника определения. В молочно-контрольную пластину наливают 1 cм3 молока и 0, 2 cм3 4%-ного раствора NaOH. Учёт реакции через несколько секунд. При положительной реакции образуется густая тягучая масса с хлопьями, отрицательная – гомогенная жидкая смесь. Ж) Определение кетоновых тел. В молоке здоровых коров кетоновые тела отсутствуют. Появляются они в нём при нарушении у животного обмена веществ, возникающего чаще всего из-за белкового перекорма. Техника определения. В пробирку налить 5 cм3 молока и добавить 1г реактива Росса (состоящего из 1г нитропруссида натрия и 100г хлористого аммония) и один кристаллик едкого натра. Через 5 мин оценивают реакцию. При наличии кетоновых тел появляется сиреневый цвет. При отсутствии – цвет желтоватый. З) Определение молока коров, больных бруцеллёзом. Кольцевая реакция. При добавлении в молоко больных бруцеллёзом коров антигена, окрашенного гематоксилином, происходит взаимодействие с антителом с образованием окрашенного в синий цвет кольца на поверхности содержимого пробирки. Техника определения. В уленгутовскую пробирку наливают 1 cм3 исследуемого молока и добавляют 1 каплю окрашенного антигена. Содержимое встряхивают и ставят в термостат (37°С) на 40 мин. Положительная реакция – кольцо окрашено в синий цвет, содержимое пробирки просветляется. Отрицательная – равномерное окрашивание содержимого пробирки. Сомнительная – слабо окрашенное кольцо, содержимое не просветляется. 2. Определение примеси анормального молока в сборном (ГОСТ 23453-90) Анормальным считается молоко с примесью молозива, а также полученное от коров в последние 7 суток лактации (стародойных), больных маститом или при патологическом состоянии организма животного, при котором увеличивается количество соматических клеток в молоке. Метод основан на взаимодействии препарата «Мастоприм»с соматическими клетками, в результате чего изменяется консистенция молока. Сборное молоко, полученное от здоровых коров, содержит в 1 см3 до 500 тыс. соматических клеток, молоко с примесью анормального – свыше 500 тыс. соматических клеток в 1 см3. Подготовка к анализу. Приготовление водного раствора препарата «Мастоприм»: 2, 5г препарата вносят в мерную колбу вместимостью 100см3 и доливают до метки дистиллированной водой, нагретой до 30-35°С. Раствор перед применением взбалтывают до равномерного распределения осадка. Срок годности раствора 1 сутки при температуре хранения 10-30°С. Техника определения. В луночку пластинки ПМК-1 вносят 1 cм3 тщательно перемешанного молока и добавляют 1 cм3 2, 5%-ного раствора препарата «Мастоприм». Молоко с препаратом интенсивно перемешивают стеклянной, пластмассовой палочкой в течение 10 с полученную смесь поднимают палочкой вверх на 5-7 см и проводят оценку результатов по таблице 18
Таблица 18
Учёт реакции с «Мастопримом»
Метод определения количества соматических клеток в молоке с применением вискозиметра ВМЛК.
Подготовка к анализу. Приготовление водного раствора «Мастоприм»: 3, 5г препарата вносят в мерную колбу вместимостью 100см3 и доливают до метки дистиллированной водой, подогретой до 30-35°С. раствор перед применением взбалтывают, срок годности – 1 сутки при температуре 10-30°С. Техника определения. В сосуд прибора наливают 5 cм3 водного раствора препарата «Мастоприм» и 10 cм3 молока. Нажать на кнопку «Пуск», произвести перемешивание смеси в течение 30 сек. По окончании перемешивания через капилляр происходит вытекание смеси. Время вытекания определяется таймером. Количество соматических клеток устанавливают по времени вытекания смеси, согласно схеме:
3. Определить наличие в молоке антибиотиков В молоко антибиотики попадают при лечении маститов и других заболеваний коров. Метод основан на подавлении размножения бактериальных клеток, на снижении выделения ферментов, обесцвечивающих добавленных к молоку индикатор. Проба с метиленовым голубым. Взять две пробирки. В одну из них отмерить 10 cм3 исследуемого молока, 1 cм3 рабочего раствора метиленового голубого, добавить 3-4 свежей культуры термофильного стрептококка. В другую пробирку (контрольную) отмерить 10 cм3 молока, заведомо свободно от антибиотиков, 1 cм3 метиленового голубого и добавить 3-4 капли культуры термофильного стрептококка. Содержимое пробирок размешать и поставить в водяную баню при температуре 38-40 0С на 5, 5 ч. Осмотреть пробирки и сделать заключение о качестве молока. Если в молоке имеется антибиотики, то термофильный стрептококк не развивается, фермента обесцвечивающего индикатор, не образуется, следовательно, молоко будет иметь синий цвет. Если антибиотик отсутствует, то добавленный метиленовый голубой обесцветится и цвет исследуемого молока будет такой же как и в контрольной пробирке. Резазуриновая проба: 1. В одну из пробирок отмерить 10 cм3 исследуемого молока, 1 cм3 раствора резазурина, добавить 3-4 капли термофильного стрептококка, чувствительного к антибиотикам. В другую пробирку (контрольную) отмерить 10 cм3 молока, заведомо свободного от антибиотиков, 1 cм3 резазурина, добавить 3-4 капли термофильного стрептококка. 2. Содержимое пробирок размешать, поставить водяную баню при температуре 400С на 45 мин. 3. Сделать заключение о качестве молока. Сине-стальной или фиолетово-розовый цвет испытуемого молока в пробирке указывает на наличие антибиотиков в молоке; отсутствие окрашивания свидетельствует о том, что в молоке нет антибиотиков.
Выполнить самостоятельно: 1. Произвести исследование молока с димастином, мастидином, маститодиагностом, маститопробом. 2. Определить наличие кетоновых тел в молоке больных и здоровых коров. 3. Определить наличие примесей анормального молока в сборном. 4. Определить наличие в молоке антибиотиков.
|