Тонкослойная хроматография (ТСХ).

Этот метод широко применяется в аналитической токсикологии при исследовании веществ, вызывающих острое отравление. Он позволяет провести качественное и полуколичественное определение яда. В основе ТСХ лежит разделение ядовитых веществ, происходящее на слое адсорбента, нанесенном на подложку. Является простым, достаточно чувствительным и доступным для практической работы, не требующим дорогостоящих приборов. Он дает возможность проводить качественный и количественный анализ пестицидов, ядов растительного и микробного происхождения.

Основные этапы анализа включают экстракцию ядовитых веществ из корма или патологоанатомического материала, очистку экстрактов от посторонних примесей, концентрирование их, хроматографическое разделение на тонком слое пластинки, проявление полученных пятен и количественное определение исследуемого вещества.

Экстракция — это процесс переноса растворенного вещества из одной жидкой фазы в другую, не смешивающуюся с ней. В качестве экстрагирующего растворителя берут обычно органические вещества, в которых хорошо растворяется яд. Например, для экстракции хлорорганических соединений используют ацетон, н-гексан, петролейный эфир, бензол, хлороформ и их смеси; для ФОС- спирты, хлороформ, этилацетат.

Навеску измельченного объекта заливают растворителем и проводят экстракцию в аппарате Сосклета, при помощи смесителей, шуттель-аппарат или путем простого настаивания в течение 12—14 ч.

Очистку экстрактов проводят методом омыления, сульфирования, распределения между двумя несмешивающимися жидкостями, осаждения жиров и белков, колоночной хроматографии. Точность исследования зависит от правильно подобранного в каждом конкретном случае метода очистки экстрактов.

Омыление применяют при определении устойчивых к щелочному гидролизу препаратов. Например, нельзя омылять ГХЦГ, ДДТ, производные мочевины, некоторые ФОС.

Сульфирование осуществляют в делительной воронке, в которой гексановый экстракт осторожно встряхивают с концентрированной серной кислотой или насыщенным раствором безводного сульфата натрия в концентрированной серной кислоте (100 гNa2SO4 в 1 лH2SO4). Органический слой обрабатывают до тех пор, пока раствор сульфата натрия в серной кислоте не станет бесцветным.

Метод распределения между двумя несмешивающимися жидкостями основан на различии коэффициентов распределения ядовитых веществ и сопутствующих веществ между двумя несмешивающимися растворителями. С этой целью обычно используют н-гексан и диметилформамид или ацетонитрил.

Осаждение жиров основано на плохой их растворимости в холодном ацетоне, для чего экстракт вымораживают в холодильнике или в приготовленных охлаждающих смесях со льда (снега) и различных солей (хлорида натрия, сульфата и карбоната натрия, нитрата аммония и натрия).

Осаждение белков осуществляется коагулирующей смесью, состоящей из 5 г аммония, 10 мл 85 % раствора ортофосфорной кислоты и до 1 л дистиллированной воды.

Колоночная хроматография проводится при помощи стеклянных колонок, заполненных силикагелем или диоксидом кремния. Концентрирование экстрактов осуществляют при помощи вакуумного ротационного испарителя, испарения с капилляром под вакуумом на водяной бане или в токе воздуха на водяной бане. Самые низкие потери препаратов бывают при использовании ротационного испарителя. Во всех случаях необходимо не повышать температуру водяной бани свыше 40°С и не упаривать досуха очищенные экстракты.

Разделение ядовитых веществ, содержащихся в концентрированном экстракте после нанесения исследуемого материала производится на пластинках с тонким слоем сорбента в хроматографических камерах, на дне которых находится подвижный растворитель.С этой целью можно использовать готовые пластинки отечественного и зарубежного производства (диафол, силуфол и др.) или приготовленные в лабораторных условиях. Пластинки для высокоэффективной ТСХ (ВЭТСХ) отличаются меньшим размером частиц (5-10 мм) и более высокой чувствительностью. Существуют пластинки для ТСХ с обращенной фазой, на которых гидрофобная часть связана с силикагелевой матрицей. Эти пластины хотя и дороже, но позволяют анализировать большее количество образцов и провести более качественное разделение.

Перед анализом на стартовую линию пластинки (1, 5 см от края) наносят в виде точек анализируемые пробы и известные количества стандартных растворов предполагаемых ядовитых веществ при помощи микропипетки или специального микрометрического шприца. Иногда во время нанесения пробы пятно обрабатывают струей теплого воздуха. Размер пятна на слое сорбента в диаметре не должен превышать нескольких миллиметров.

За 1 ч до анализа в хроматографическую камеру заливают подвижный растворитель, уровень которого не должен превышать 0, 5 см. Пластинки помещают в растворитель и камеру плотно закрывают. После поднятия фронта растворителя по сорбенту на расстояние 1 см от верхнего края пластинки ее вынимают, отмечают верхнюю границу подъема растворителя (линию фронта), высушивают на воздухе и обрабатывают проявляющим реагентом.

Качественная идентификация ядовитых веществ проводится по величине Rf (отношение расстояния от линии старта до центра пятна к расстоянию от линии старта до линии фронта), которая для каждого яда постоянна. Результаты ТСХ регистрируют в виде коэффициентов удерживания (Rf). Rf рассчитывается следующим образом:

_{Расстояние, пройденное от старта анализируемым образцом}

Rf= ---------------------------------------------------.

^{Расстояние, пройденное от старта фронтом растворителя}

Более удобным является показатель Rfx 100 (hRf), особенно в случаях, когда используется стандартная пластина 10 см. На воспроизводимость Rf может оказать влияние ряд факторов, но это влияние может быть сведено к минимуму, если вместе с каждым образцом анализируются стандартные соединения.

Развитие аналитической ТСХ идет по пути повышения чувствительности, унификации процесса и условий хроматографии. Использование готовых систем, пластин, камер, проявителей и идентификационных атласов гарантирует высокую воспроизводимость, надежность анализа и исключает субъективный фактор.

Количественный анализ заключается в измерении площадей пятен исследуемого вещества и известного количества стандартного вещества. Более точный результат дает определение интенсивности окраски и диаметра пятен при помощи специальных приборов- денситометров. Прибор регистрирует их в виде пиков, по площади и высоте которых рассчитывают количество исследуемого вещества.