Иммуно-химические методы исследования.

Современные иммунохимические методы анализа токсических веществ обладают высокой чувствительностью, групповой специфичностью, простотой исполнения, позволяют анализировать одновременно большое количество проб без специальной подготовки. Поэтому они удобны для скринингового определения.

Данные методы основаны на реакциях взаимодействия между определяемым токсическим веществом (антигеном) и выработанными к нему специфичными антителами. Для визуализации результатов реакции в один из компонентов вводится «метка». В зависимости от природы последней (метода детектирования) различают несколько видов иммунного анализа. Наиболее часто употребляемые из них в токсикологическом анализе приводятся в таблице.

Таблица 2

Классификация иммунохимических методов анализа

В настоящее время отечественными и зарубежными производителями выпускаются готовые коммерческие наборы реактивов- диагностикумы, позволяющие определять основные классы лекарственных и токсических веществ с гарантированным пределом определения 50-500 нг/мл

В реакционную среду помещают определяемое вещество (антиген) и «меченый» антиген, которые конкурентно взаимодействуют с ограниченным числом мест связывания антител. В иммуноферментных методах в качестве метки используются ферменты, которые окисляют хромогенный субстрат. При связывании меченого антигена с антителом фермент теряет свою активность и не изменяет окраски хромогенного субстрата. Об интенсивности реакции судят по изменению окраски, которая зависит от концентрации определяемого вещества. По технике проведения различают гомогенный и гетерогенный ИФА. В гомогенном ИФА все компоненты реакции находятся в одном агрегатном состоянии - растворе. В наиболее распространенных модификациях гетерогенного анализа антитела иммобилизуются на твердом носителе (пробирках, планшетах, бусинах). Хромогенный субстрат в этом случае добавляется после удаления компонентов, которые не прореагировали. Он взаимодействует с ферментом, связанным с иммобилизованным антителом, и меняет окраску. Если концентрация определяемого вещества значительно превышает концентрацию меченого антигена, то после удаления последнего из реакционной среды, ферменты в системе отсутствуют и окраска не изменяется (положительный ответ). Изменение окраски регистрируется на фотоколориметре, обычно выполненном в виде анализатора для диагностикумов конкретной фирмы. Поскольку антитела специфичны к определенному соединению, то существуют наборы отдельно на каждый вид исследуемых соединений.

Гомогенный ИФА является весьма быстрым, но менее чувствителен, чем гетерогенный анализ. Время определения одного показателя составляет 1—30 мин, включая обработку результатов, а предел обнаружения- 500-1000 нг/мл. Гетерогенный ИФА позволяет обнаружить 50-100 нг/мл, но более продолжителен (2-3 ч).В ИФА нередки случаи ложноположительных или ложноотрицательных результатов, поскольку некоторые компоненты крови, метаболиты лекарственных и токсических веществ способны изменять скорость ферментативных реакций. Ферменты, как и все белки, меняют активность под действием таких факторов, как нагревание, разведение образцов, изменение рН, присутствие солей тяжелых металлов, антикоагулянтов, микроорганизмов. Поэтому результаты ИФА значимы только в комбинации с подтверждающими методами.