Приложение 1. Питательные среды

С ы в о р о т о ч н ы й а г а р

В качестве основы используют 1, 2—1, 5-процентный агар (рН = 7, 4), приготовленный на бульоне из рыбного гидролизата, бульона из перева­ра Хоттингера (аминный азот в бульоне 150—180 мг/мл) или на сухом питательном агаре специального назначения. К 80 мл расплавленного и остуженного до температуры 50 °С агара добавляют 20 мл инактивированной при температуре 56 °С в течение 30 мин сыворотки, консервиро­ванной хлороформом, или без консерванта (при инактивировании сыворотки консервант улетучивается). После перемешивания среду разлива­ют в чашки. Среда годна к употреблению только в течение 48 ч при хра­нении ее в холодильнике. Перед посевом чашки, хранящиеся в холодиль­нике, должны быть подсушены и подогреты до температуры 37 °С.

С ы в о р о т о ч н ы й а г а р с р и с т о м и ц и н о м

К 80 мл расплавленного и остуженного агара (такого же, как и для приготовления сывороточного агара) добавляют 20 мл сыворотки и 0, 1 мл раствора ристомицина, содержащего 2000 ЕД/мл среды (конечная кон­центрация антибиотика в питательной среде 20 ЕД/мл). Для экономного расходования антибиотика препарат разводят стерильным изотоничес­ким раствором до рабочей концентрации и затем разливают по стериль­ным пенициллиновым флаконам или центрифужным пробиркам, закры­вают их ватными или резиновыми пробками и замораживают в моро­зильной камере. Рабочий раствор сохраняют в морозильной камере до момента использования. В случае необходимости раствор оттаивают и добавляют в среду. Например, во флакон, содержащий 100 мг (100 000 ЕД) ристомицина, вносят 5 мл стерильного физиологического раствора. Полученное разведение препарата является рабочим. Этот раствор разливают по 0, 5 мл, замораживают и сохраняют несколько ме­сяцев

.

С ы в о р о т о ч н ы й а г а р с л и н к о м и ц и н о м

К 80 мл расплавленного и остуженного агара добавляют 20 мл сыворотки и 0, 5 мл раствора линкомицина в концентрации 1000 мкг/мл.

Конечная концентрация антибиотика в среде 5 мкг/мл питательной среды. Раствор линкомицина можно хранить при температуре 4 °С в те­чение шести месяцев.

П о л у ж и д к и й а г а р д л я х р а н е н и я к у л ь т у р
и о б о г а щ е н и я л и к в о р а

К 4 мл 0, 1-процентного полужидкого питательного агара (рН = 7, 4), приготовленного на бульоне из перевара Хоттингера или рыбного гидролизата, добавляют 1 мл предварительно инактивированной сыворотки с консервантом или без него. Пробирки ставят на сутки в термостат для контроля. Среду сохраняют в холодильнике и перед посевом подогревают в термостате. Эту же среду используют для обогащения спинномозговой жидкости и посева крови. При этом внесение сыворотки нецелесообразно.

П л о т н ы й а г а р д л я х р а н е н и я к у л ь т у р п о д в а з е л и н о м

Сывороточный агар, используемый для посева на чашках, разливают по пробиркам столбиком. Культуру засевают уколом и ставят в термо­стат (37 °С) на сутки. При появлении роста по ходу укола и в виде бляш­ки на поверхности среды пробирку заливают 1, 5—2, 0 мл стерильного ва­зелинового масла. Культуры под вазелином можно хранить без пересевов до трех месяцев в термостате.

Т и а м и н – ц и с т и н – г л у т а м и н о в ы й а г а р с у х о й

36 г порошка высыпать в колбу с 1000 мл холодной дистиллированной воды, размешать, довести до кипения, автоклавировать 30 мин при 115 °С. Стерильно разлить. Перед посевом в расплавленный и охлажденный до 50°С агар добавить 15—20% лошадиной сыворотки.

Э р и т р и т а г а р с у х о й

36 г порошка размешать в I л холодной дистиллированной воды. Ки­пятить 1—2 мин до образования быстрооседающей крупнопузырчатой пены. Профильтровать через слой ваты. После разлива автоклавировать при 1 атм 20 мин. Перед посевом добавить 20% сыворотки.

Т р а н с п о р т н ы е с р е д ы

Полужидкая среда для тампонов. К 80 мл полужидкого 0, 1-процент­ного питательного агара на бульоне из перевара Хоттингера (рН = 7, 4-7, 6) или из рыбного гидролизата (пасты) добавляют 20 мл лошадиной сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота и 0, 1 мл раствора ристомицина, со­держащего 20 000 ЕД/мл (конечная концентрация в питательной среде 20 ЕД/мл). Среду разливают в пробирки по 3 мл, выдерживают двое су­ток в термостате для контроля и затем хранят в холодильнике. Перед использованием пробирки со средой подогревают в термостате или при комнатной температуре, но в теплом месте.

При использовании сухого питательного агара среду готовят из расчета 400 мг сухого питательного агара на 100 мл I-процентной пептонной воды или мясо-пептонного бульона (рН =7, 4-7, 6), затем стерилизуют в автоклаве при температуре 120º С в течение 30 мин. Перед употребле­нием в среду вносят те же ингредиенты и в тех же соотношениях, что и в среду, приготовленную на бульоне Хоттингера. Среда с аспарагином в качестве транспортной непригодна.

Среда 199 или среда Игла. Одну из готовых питательных сред разли­вают стерильно в пробирки по 2 мл и сохраняют в холодильнике. Перед использованием подогревают в термостате при 37 °С. Материал на тампо­нах, погруженных в питательную среду для накопления менингококка, рекомендуется выдерживать в термостате при 37 °С в течение 2, 5—3 ч.

С р е д ы с у г л е в о д а м и

А. Плотные среды. Готовят на той же питательной основе, что и пре­дыдущие. К 75 мл агаровой основы добавляют 0, 9 г одного из углеводов (глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза, фруктоза) и 3, 6 мл раствора ин­дикатора фенолового красного до появления рябинового окрашивания. Агар стерилизуют текучим паром в течение трех дней по 30 мин или одно кратно в течение 30 мин при 0, 5 атм. Для приготовления раствора инди­катора фенолового красного (фенол-рот) смешивают 0, 4 г порошка фе­нол-рот с 16 мл 0, 1 % NaOH и выдерживают в термостате до полного рас­творения при частичном встряхивании. Затем раствор доводят до объема 200 мл дистиллированной водой, разливают во флаконы и стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.

Перед употреблением среду растапливают в водяной бане, охлажда­ют до температуры 45-50°С, добавляют 20 мл инактивированной нор­мальной сыворотки и разливают в пробирки или в чашки. Учет результа­тов производят через 24 ч инкубации в термостате. При разложении ка­кого-либо углевода с образованием кислоты рябиново-красный цвет сре­ды в секторе роста культуры меняется на ярко-желтый. При отсутствии расщепления сохраняется исходный цвет среды.

Б. Жидкие среды. К 7 мл стерильного бульона стерильно добавляют 3 мл лошадиной или бычьей сыворотки, 0, 15 мл раствора бром-тимол-си­него и 0, 85 мл 4-процентного раствора одного из углеводов. Среда имеет салатно-зеленый цвет.

Среды сохраняются в холодильнике в течение месяца. В день поста­новки теста среды разливают в стерильные агглютинационные пробирки по 0, 3—0, 4 мл. Испытуемую культуру засевают «полной» петлей до види­мого помутнения среды. Одну пробирку с каждым углеводом оставляют незасеянной и используют для контроля.

Пробирки помещают в термостат на одни сутки. При сбраживании углевода среда желтеет.

На водопроводной воде готовят 4-процентные растворы углеводов, разливают по 5, 0 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при температу­ре 110°С в течение 15 мин. После стерилизации к ним добавляют стериль­ный 0, 1-процентный раствор NаОН из расчета по 0, 25 мл на 5 мл 4-про­центного раствора глюкозы, сахарозы или лактозы и по 0, 3 мл на 5, 0 мл 4-процентного раствора мальтозы и левулезы (фруктозы).

Для приготовления 0, 4-процентного водного раствора бром-тимол-синего, берут 0, 1 г этого красители, заливают 3, 2 мл 0, 2-процентного раствора NаОН, растирают стеклянной палочкой и оставляют в термостате на сутки до полного растворения, затем к раствору доливают дистиллированную воду до объема 25, 0 мл. Раствор хранят под резиновой пробкой.

При подозрении на загрязнение из пробирки с разложившимся углеводом в жидкой или полужидкой среде делают высев на сектор (1/4) чашки сывороточного агара. В случае примеси посторонней флоры испытываемая культура подлежит очистке и повторной проверке.

К р о в я н о й а г а р

Кровяной агар готовят на тех же питательных основах, что и сыворо­точный агар. К расплавленному и охлажденному до температуры 50°С агару добавляют 5—7 % дефибринированной бараньей иди кроличьей крови (только не человека), тщательно перемешивают, избегая образо­вания пены и пузырьков, и разливают в чашки Петри.

«Ш о к о л а д н ы й» а г а р (к и п я ч е н ы й)

Для приготовления этой среды может быть использована кровь любо­го животного или человека.

Питательный агар с рН = 7, 3-7, 4 растапливают, добавляют 5 % цельной или дефибринированной крови и ставят в кипящую воду на 3 мин. Затем вновь добавляют 5 % крови, тщательно перемешивают и ставят в кипящую баню на 3 мин. После этого агар взбалтывают и разливают по чашкам Петри или пробиркам для приготовления косяков.

«Ш о к о л а д н ы и» а г а р.

Для приготовления этой среды может быть использована только кровь барана, кролика или лошади, так как кровь других животных может содержать V-антифактор, который необходимо инактивировать кипячением.

Питательный агар с рН = 7, 3-7, 4 растапливают и охлаждают до температуры 60°С. Стерильно добавляют 5 % цельной или дефибринированной крови. Тщательно перемешивают и ставят на 2- 3 мин в водяную баню при температуре 80 °С. После этого вторично добавляют 5 % крови и вновь ставят в водяную баню при температуре 80 С. на 2-3 мин. Затем агар тщательно взбалтывают и разливают по пробиркам и чашкам Петри. Среду хранят не более двух недель.

Ж е л ч н ы и а г а р

К расплавленному и охлажденному агару на обычной основе добавляют 5 % желчи, фильтрованной через стерильную вату, разливают по флаконам и стерилизуют текучим паром в течение трех дней подряд по 30 мин или однократно при температуре 110°С в течение 30 мин.

Перед разливом в чашки Петри в каждый флакон с растопленным и охлажденным до температуры 50°С желчным агаром добавляют 20% инактивированной в течение 30 мин лошадиной сыворотки.

С р е д а с с а х а р о з о й д л я о п р е д е л е н и я

п р о д у к ц и и п о л и с а х а р и д о в

К обычно употребляемой плотной среде для культивирования менинго­кокков добавляют 5 % сахарозы, среду разливают в чашки Петри, доба­вив 20 % сыворотки. Производят густой высев культуры петлей сектором, на одну чашку можно посеять несколько штаммов. Через 48 ч инкубации в термостате на поверхность выросшей культуры наносят одну каплю водного раствора Люголя, обычно употребляемого при окрашивании маз­ков по Граму. Реакция считается положительной при образовании буро­го окрашивания выросшей культуры.

К о н т р о л ь п и т а т е л ь н ы х с р е д

В качестве тест-культуры используют только свежевыделенные штам­мы менингококка, которые сохраняют в лаборатории на полужидком ага­ре при температуре 37°С. Выросшую на скошенном сывороточном агаре культуру смывают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Исходную взвесь готовят по стандарту мутности 10 ЕД — т.е. I млрд. микробных тел в I мл. Затем берут предварительно приготовленные шесть пробирок с 4, 5 мл изотонического раствора хлорида натрия и готовят десятикратные разведения. В пятой пробирке содержится 10 тыс. микроб­ных клеток, в шестой — 1 тыс. Свежеприготовленные взвеси должны быть использованы немедленно.

Из пятого и шестого разведений делается высев по 0, 1 мл взвеси на чашки со свежеприготовленными испытуемыми средами (каждый образец должен быть посеян не меньше чем на две чашки). Нанесенный мате­риал тщательно растирается шпателем, причем для каждой чашки ис­пользуют отдельный шпатель. В качестве контроля используется проверенная среда предыдущей варки.

Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 18 ч. Обращают внимание на сроки появления колоний менингококка, их число и величи­ну. Оптимальными считаются среды, на которых колонии появляются не позднее, чем через 20-22 ч, а через 24 ч их величина достигает 1-1, 5 мм. На чашках из пятого разведения вырастают сотни колоний, из шестого разведения - десятки. Питательные среды, не отвечающие этим требова­ниям, при добавлении к ним 20-процентной нормальной инактивированной сыворотки, непригодны для культивирования менингококка. Контро­лю подлежит каждая партия приготовленной среды.