Приложение 8. Методика реакции непрямой гемагглютинации для выявления антител при меннигококковой инфекции

1.Показания к проведению серологических исследований.

Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с менингококковыми эритроцитарными диагностикумами серогрупп А, В и С проводят в следующих случаях:

а) как дополнительный метод диагностики менингококковой инфекции. Обязательным требованием является исследование сывороток крови от больных, взятых в разные сроки от начала заболевания, т.е. в динамике. Оптимальным вариантом является обследование всех лиц (скрининг) с подозрением на генерализованные формы менингококковой инфекции (ГФМИ), что позволит существенно увеличить процент лабораторного подтверждения ГФМИ (у взрослых - до 80%, у детей - до бО% случаев);

б) для ретроспективного выявления локализованных форм менингококковой инфекции в очагах заболевания;

в) при проведении иммуно-эпидемиологических исследований с целью определения серонегативных контингентов;

г) при оценке иммунологической эффективности противоменингококковой вакцинации.

1. Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитарными менингококковыми диагностикумами.

Реакцию непрямой гемагглютинации можно ставить как макро-, так и микрометодом, в последнем случае используют микротитры системы 'Такачи". Различия между этими методами заключаются лишь в объемах используемых ингредиентов и сроках учета результатов реакции. При макрометоде реагирующая смесь в каждой лунке состоит из 0, 5 мл соответствующего разведения сыворотки крови и 0, 25 мл диагностикума. В микрометоде объемы соответственно уменьшаются: 0, 05 мл сыворотки и 0, 025 мл диагностикума.

Учет результатов исследования в микротитраторе проводят спустя 2 часа инкубации в термостате; при макрометоде иногда требуется дополнительная экспозиция в течение 1-2 часов при комнатной температуре.

2.1 Необходимые реагенты и приборы:

• эритроцитарные менингококковые серогруппы А, В и С диагностикумы;

• сыворотки диагностические менингококковые группоспецифические А, В и С*;

• нормальная кроличья сыворотка **, сухая кроличья плазма или бычий сывороточный альбумин ***;

• исследуемый материал (сыворотка крови человека);

• полистироловые пластины с лунками, серологические пробирки или микротитраторы с У-образными лунками (системы " Такачи");

• термостат для поддержания температуры 37° С;

• водяная баня для поддержания температуры 56°С;

• потенциометр для измерения рН растворов;

• пипетки стеклянные мерные (ГОСТ 20-292-74);

• дозаторы пипеточные П: на 0, 5; 0, 05 (2Т2.933.053 ТО);

• хлорид натрия (ЖС1);

• натрий фосфорнокислый двузамещенный (Ма2НР04-12Н20);

• калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2PO4);

• дистиллированная вода.

2.2 Подготовка ингредиентов.

2.2.1 Приготовление исходного забуференного физиологического раствора рН 7, 2 (ЗФР).

В 0, 5 л дистиллированной воды растворяют: хлорида натрия NаСl-8, 65 г; натрия фосфорнокислого двузамещенного (Nа2НР04- 12Н2О) - 1, 92 г; калия фосфорно-кислого однозамещенного (КНзР04) - 0, 44 г.

Объем раствора доводят до 1 л дистиллированной водой. После растворения солей проверяют рН раствора, который должен быть равен 7, 2. Раствор фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при 0, 5 атм. 30 мин.

ЗФР необходим для приготовления стабилизирующего буфера, в котором проводят титрование исследуемых сывороток крови.

2.2.2. Стабилизирующий буфер.

В качестве стабилизатора можно применять нормальную кроличью сыворотку (НКС), сухую кроличью плазму или бычий сывороточный альбумин (БСА). Используемая НКС не должна давать неспецифической (спонтанной) реакции гемагглютинации с эритроцитарными диагностикумами. Инактивированную при +56°С в течение 30 минут НКС или плазму добавляют к ЗФР из расчета 1, 0 мл на 100, 0 мл (получают 1% раствор), БСД не инактивируют. Концентрация БСА в ЗФР - 0, 5%.

* Входят в набор эритроцитарных менингококковых диагностикумов. ** Нормальную кроличью сыворотку получают от здоровых кроликов. *** Кроличья плазма и бычий сывороточный альбумин - коммерческие препараты.

2.2.3 Взятие крови.

Для проведения серологических исследований кровь от больных ГФМИ (генерализованными формами менингококковой инфекции) или с подозрением на эту инфекцию забирают из локтевой вены с соблюдением обычных правил асептики; при массовых серологических исследованиях кровь берут из пальца.

После образования сгустка, полученную сыворотку, отсасывают стерильной пипеткой в стерильную посуду (пробирки, ампулы). Хранят сыворотку крови в холодильнике при +4° С. В реакции исследуют сыворотки крови без признаков пророста. Перед постановкой РНГА сыворотки разводят 1: 5 исходным буфером (ЗФР). Титрование сывороток крови проводят в стабилизирующем буфере.

3. Учет реакции.

Реакцию оценивают по общепринятой 4-х плюсовой системе (см. Наставление по применению эритроцитарных менингококковых диагностикумов).

За титр противоменингококковых антител принимают максимальное разведение сыворотки крови, в котором наблюдают четко выраженную агглютинацию эритроцитов с интенсивностью не менее чем на 2+, при условии, что в предыдущих лунках реакция шла на 4+ или 3+. Сыворотки крови с разведения 1: 5 и выше с четко выраженной агглютинацией эритроцитов, оценивают как положительные.

4. Рекомендуемые сроки, кратность обследования и трактовка серологических результатов.

При выборе оптимальных сроков и кратности обследования больных ГФМИ и для правильной трактовки серологических результатов необходимо принимать во внимание ряд факторов, влияющих на уровень антител: возраст больного, преморбидный фон, клиническую форму, тяжесть и период болезни, сопутствующие заболевания, серологические особенности возбудителя. При менингококковой инфекции, также как и при других инфекционных заболеваниях, правильная оценка результатов серологических исследований может быть дана только при их сопоставлении с эпидемиологическими и клиническими данными.

Оптимальные сроки взятия крови у больных ГФМИ - первые дни болезни (1-3 день), вторая, третья и последующие недели болезни. Первую сыворотку крови необходимо брать сразу же при поступлении больного в стационар, последующие через 7-10 дней.

4.1. РНГА при генерализованных формах менингококковой инфекции.

4. 1. 1. РНГА с диагностикумами А и С.

Антитела к группоспецифическим полисахаридам менингококков серогрупп А и С при ГФМИ можно выявить уже в первые дни болезни. Число серо-позитивных лиц среди взрослых больных составляет в эти сроки около 40%. Максимальный уровень антител отмечается на 2-3-ей неделях болезни, с 4-5 недели уровень антител постепенно снижается.

За условно диагностический титр антител к полисахаридам менингококков серогрупп А и С у взрослых и детей старше 3-х лет принимают положительную реакцию в разведении сыворотки крови 1: 40 - 1: 80, т.к. у лиц, не инфицированных менингококками в момент обследования, антитела в таких титрах встречаются сравнительно редко (9-11%).

У детей в возрасте до 1 года продукция антител выражена слабо, в связи с чем положительные реакции наблюдаются обычно в более поздние сроки (со 2-ой недели болезни). У детей моложе 3-х лет за условно-диагностический титр антител к полисахаридам А и С принимают положительную реакцию в разведении 1: 20 и выше, т.к. при отсутствии менингококковой инфекции у детей этого возраста антитела или не обнаруживаются, или встречаются в единичных случаях в титрах не выше, чем 1: 5- 1: 10.

Интенсивность антителообразования не одинакова при различных клинических формах менингококковой инфекции. При менингококкцемии и сочетанных формах (менингококкцемия + менингит) уровень антител обычно выше, чем при других формах болезни.

При тяжелом течении ГФМИ и особенно при инфекционно-токсическом шоке противоменингококковые антитела обнаруживаются в низких титрах, в отдельных случаях не выявляются вообще. При очень тяжелом течении болезни, особенно при наличии тяжелых осложнений (отек и набухание мозга), антителообразование выражено слабо: в остром периоде болезни обнаруживают около 10" /о серопозитивных проб с низкими титрами (1: 5 - 1: 10). В дальнейшем, при улучшении состояния больных титры антител и число серопозитивных проб может возрастать.

Обнаружение уже на 1 неделе болезни антител к полисахаридам менингококков серогрупп А и С в титре в титре 1: 160 и выше подтверждает менингококковую этиологию заболевания. В некоторых случаях такие титры антител, обнаруженные на 1 неделе болезни, могут сохраняться и в более поздние сроки заболевания. Хотя у данных больных не наблюдается сероконверсий, высокие показатели РНГА могут служить достаточным основанием для серологического подтверждения диагноза ГФМИ.

Диагноз ГФМИ определяется как этиологически подтвержденный при наличии динамики (четырехкратного и более) нарастания уровня антител. При двукратном нарастании титра антител - диагноз оценивается как подтвержденный лишь при выраженной клинической картине.

Число этиологически подтвержденных случаев ГФМИ методом РНГА может достигать: у взрослых 80%, у детей, в среднем 70% (в возрастной группе детей до 3-х лет - 60%, в старших возрастных группах - 80%).

4.1.2. РНГА с диагностикумом серогруппы В.

При интерпретации серологических данных, полученных при работе с эритроцитарным диагностикумом на основе полисахарида менингококков серогруппы В, необходимо учитывать следующие моменты. Полисахарид менингококков серогруппы В слабый иммуноген, его химическая структура идентична полисахариду Е.Соli К1. Носительство менингококков этой серогруппы может достигать 50% и более от числа серогруппируемых штаммов менингококков, выделенных от здоровых лиц, что может отражаться на высоком фоновом уровне антител к полисахариду В среди населения (в 50% случаев могут определяться антитела в титре 1: 80 и выше).

Генерализованные формы менингококковой инфекции, обусловленные менингококками серогруппы В, наиболее часто (до 60%) диагностируются у детей первых трех лет жизни, у которых антителообразование выражено слабо. При ГФМИ у взрослых, в большинстве случаев, в первые дни болезни уровень антител к менингококкам серогрупп В составляет 1: 20 - 1: 40, с последующей сероконверсией на 2-3 неделях. В отдельных случаях (14%) содержание антител на 2-3 неделях болезни может достигать титров 1: 640 - 1: 1280 и выше.

Учитывая данные о широкой циркуляции менингококков серогруппы В среди населения, определить условно-диагностический титр антител к менингококкам этой серогруппы довольно сложно. Серологическим подтверждением клинического диагноза ГФМИ, вызванной менингококками серогруппы В, можно считать нарастание уровня антител с 1: 160 и выше; у детей с 1: 40 и выше.

4.1.3. Групповая специфичность РНГА.

При постановке РНГА с набором эритроцитарных диагностикумов может выявляться одновременное присутствие антител к нескольким полисахаридам. В таких случаях серогруппу менингококков, вызвавших заболевание у данного больного, определяют по динамике нарастания уровня антител к одному из полисахаридов. При этом разница показателей парных сывороток должна быть не меньше чем на два разведения. При получении одинаковых титров антител к двум полисахаридам в условно-диагностических титрах, диагностируется ГФМИ без установления серогруппы возбудителя.

4.2. РНГА при локализованных формах менингококковой инфекции (назофарингит и бактерионосительство).

При локализованных формах менингококковой инфекции серологические исследования не следует рассматривать как метод диагностики, поскольку вопрос о носительстве или менингококковом назофарингите решается на основании бактериологического обследования. Но в ряде случаев при проведении исследований в очагах ГФМИ серологические данные могут послужить дополнительным тестом, ретроспективно подтверждающим клинико-эпидемиологический диагноз менингококковой инфекции. При этом следует проводить обязательное исследование парных образцов сывороток крови, полученных с 10-11 дневным интервалом.

При назофарингитах антителообразование более выражено, чем при бактерионосительстве. У больных назофарингитом менингококковой этиологии в 90% случаев выявляются противоменингококковые антитела, причем в 50% случаев с титрами от 1: 40 и выше. Среди бактерионосителей независимо от серогруппы выделенного возбудителя специфические антитела определяют в 65% случаев, а с титрами от 1: 10 и выше у 30% носителей.

В сыворотках крови, полученных от носителей, так же как и от больных (см. п. 4.1.3.), могут выявляться антитела к нескольким полисахаридам менингококков. Нарастание антител к гомологичной серогруппе чаще отмечают при носительстве менингококков серогруппы А. В отдельных случаях динамика антител (сероконверсия) не позволяет серологически установить доминирующую серогруппу менингококков, тогда определяют носительство без установления серогруппы.

4.3. РНГА при иммуноэпидемиологических исследованиях.

Целью иммуноэпидемиологических исследований является определение числа лиц вероятно восприимчивых к менингококковой инфекции и группа риска. Анализ проводят по числу серопозитивных и серонегативных лиц с учетом существующей эпидемической ситуации.

Например, в период эпидемического неблагополучия увеличивается число серопозитивных лиц и соответственно уменьшается число серонегативных к эпидемической серогруппе менингококков. В период спорадической заболеваемости, наоборот, растет число серонегативных лиц.

При проведении иммуноэпидемиологических исследований объем репрезентативных выборок устанавливается эпидемиологом в соответствии с численностью и качественным (срок службы) воинского коллектива.

Определяемый фоновый уровень противоменингококковых антител связан с заболеваемостью менингококковой инфекцией на данной территории и уровнем носительства. Наиболее высокий уровень антител в разные эпидемические периоды определяют к менингококкам серогруппы В, что, возможно, отражает их серологическое родство, с Е. соli К1, M. catarrhalis, непатогенными нейссериями. При этом число серопозитивных проб с титрами антител 1: 20 и выше может достигать 90%.

К менингококкам серогруппы С уровень антител наименьший, число серопозитивных сывороток крови с титром антител 1: 20 и выше составляет 8%.

Уровень антител к менингококкам серогруппы А дает достаточно четкую характеристику эпидемиологической ситуации и отражает широту циркуляции возбудителя.

Анализ серологических результатов эпидемиологических исследований проводят на основании расчета следующих показателей:

а) процента от серонегативных проб, полученных с каждым из эритроцитарных диагностикумов (А, В и С), который может отражать число вероятно восприимчивых лиц к менингококковой инфекции;

б) процента серопозитивных проб (все серопозитивные сыворотки крови, начиная с разведения 1: 5 и выше), из числа которых выделяют пробы с титрами антител:

• в возрастной группе до 3-х лет с 1: 10 и выше к полисахаридам А и С, с 1: 20 и выше к полисахариду В;

• в старших возрастных группах детей и у взрослых с 1: 20 и выше к полисахаридам А и С, с 1: 80 и выше к полисахариду В. Процент сывороток крови с указанными выше уровнями антител отражает доминирующие на данной территории серогруппы менингококков.

4.4 Применение РНГА для оценки эффективности вакцинопрофилактики менингококковой инфекции.

Формирование поствакцинального иммунитета носит группоспецифический характер. В связи с этим, в зависимости от используемой для профилактики менингококковой вакцины, серологические исследования для оценки эффективности вакцинации проводят с применением РНГА с гомологичным эритроцитарным диагностикумом.

При вакцинации взрослых специфические противоменингококковые антитела к полисахариду А выявляют в высоких титрах (1: 10 - 1: 640 и выше) не менее чем у 80% привитых уже на 3-4 неделе после вакцинации. На протяжении последующих 6-8 месяцев у привитых титры антител несколько снижаются, но сохраняются на повышенном уровне более двух лет.