Практичне заняття №8

Тема. Методи вивчення спадковості людини: цитогенетичний, біохімічний. Хромосомні та генні хвороби, їх діагностика.

Вид заняття: практичне.

Актуальність теми: знання питань теми дозволяє майбутнім фармацевтам з’ясувати матеріальну основу розвитку організму, життєдіяльності організму людини в нормі і при різних патологічних станах; використовувати одержані знання для вирішення практичних медичних задач, зокрема при медико-генетичному консультуванні.З’ясування генетичної природи спадкових захворювань – важливе завдання медицини. Щорічно у 4-5 % новонароджених спостерігаються значні спадкові вади, які ведуть до порушення багатьох життєвоважливих процесів. В зв’язку з підвищенням фону іонізуючої радіації і забрудненням довкілля мутагенами кількість спадкових змін у людини зростає; щорічно реєструється 3-4 нових спадкових аномалії.

Мета заняття: ознайомитись з методами цитогенетичного аналізу спадковості людини: каріотипування і складання ідіограм з використанням мікрофотографій метафазних хромосом; визначення статевого хроматину на тимчасових препаратах інтерфазних клітин слизової оболонки ротової порожнини. Вивчити порушення хромосомного набору людини в системі аутосом і статевих хромосом як причину хромосомних захворювань.

Зміст теми:

1. Цитогенетичний метод вивчення спадковості людини, його можливості.

2. Метод каріотипування, використання в клінічній практиці.

3. Метод визначення Х- та У-статевого хроматину, використання для ідентифікації статі.

4. Класифікація спадкових захворювань.

5. Хвороби, зумовлені зміною кількості аутосом.

6. Хвороби, зумовлені зміною кількості статевих хромосом.

7. Біохімічний метод вивчення спадковості людини.

8. Генокопії та генокопії.

9. Методи пренатальної діагностики та медико-генетичне консультування.

Обладнання для проведення заняття: навчальні таблиці, методичні матеріали, таблиці каріотипів людини в нормі і при хромосомних захворюваннях, фотокаріограми.

Інтегративні зв’язки теми: знання питань теми необхідні студентам при вивченні молекулярної і медичної генетики, розмноження і онтогенезу організмів, еволюційної теорії, життєдіяльності організму в нормі і при різних патологічних станах як на теоретичних, так і клінічних кафедрах.

Хід заняття:

1. Контроль вихідного рівня знань студентів з даної теми (на основі перелічених питань змісту теми)

2. Практична частина

2.1. Характеристика етапів роботи

2.1.1 Цитогенетичний метод вивчення спадковості людини

а) метод каріотипування

Метод каріотипування запропонували шведські вчені Тійо і Леван у 1956р. Хромосоми людини можна досліджувати у лімфоцитах периферичної крові, клітинах кісткового мозку, амніотичної рідини, хоріона, волосяних фолікулах, шкірі, фібробластах, тканинах, що регенерують та ін.

Найчастіше каріотип досліджують у лімфоцитах периферичної крові. Для цього венозну кров центрифугують, виділяють лейкоцити. Помістивши їх у спеціальне поживне середовище з фітогемаглютиніном (ФГА), який стимулює поділ лімфоцитів. Суспензію витримують у термостаті 72 год. За 3 год до кінця інкубації додають колхіцин, який затримує поділ клітин на стадії метафази. Потім до культури лімфоцитів додають гіпотонічний розчин КСl, в якому клітини збільшуються в об’ємі, а хромосоми з області екватору розподіляються по всій клітині. Препарат забарвлюють ядерними барвниками і вивчають у світловому мікроскопі з імерсійним об’єктивом. Сукупність хромосом однієї клітини у метафазі називають метафазною пластинкою. Метафазну пластинку можнатакож сфотографувати і вивчити кількість і форму хромосом на мікрофотографії.

Проаналізувати фотокаріограми нормальних і патологічних каріотипів (синдром Патау, Едвардса, Дауна, Шерешевського-Тернера, Клайнфельтера, трисомія Х, трисомія У).

Каріотип 1 Каріотип 2

Каріотип 3 Каріотип 4.

Фотокаріограми нормального і патологічних каріотипів людини

Метод каріотипування дозволяє діагностувати багато спадкових захворювань, вивчати мутаційний процес, перебудови хромосом у клітинах, які вступили у поділ або його завершили. Широко поширений метод диференційного забарвлення хромосом, який дозволяє відрізнити кожну хромосомну пару.

На хромосомномний аналіз скеровуються пацієнти:

- з множинними вродженими вадами;

- діти з затримкою фізичного і психомоторного розвитку;

- особи з недиференційованими формами олігофренії (недоумства);

- діти з порушенням статевого дозрівання;

- жінки з порушенням менструального циклу (первинна або вторинна аменорея)

- неплідні сім’ї;

- жінки, у яких спостерігається невиношування вагітності (викидні, мертвонародження).

б) визначення Х- та У-статевого хроматину

Статевий хроматин в інтерфазних ядрах обумовлений спіралізацією однієї з Х-хромосом, яка переходить в стан конститутивного хроматину. Це зумовлено механізмом, який вирівнює баланс генів статевих хромосом у клітинах самців і самок (дозова компенсація генів).

Гетерохроматизація Х-хромосоми проходить на ранніх стадіях ембріонального розвитку. Х-хроматин формується одночасно у всіх клітинах ембріона. В індивідів, що мають декілька Х-хромосом, тільки одна з них залишається в еухроматиновому стані, всі інші гетерохроматинізуються. Х-хроматин, в честь автора, що відкрив його, названий тільцем Барра. У людиниінактивація Х-хромосоми контролюється генетично. Цей процес дозволяє вирівняти баланс генів статевих хромосом у клітинах самців і самок (один з механізмів дозової компенсації генів). Між числом тілець статевого хроматину і числом Х-хромосом в ядрі єіснує прямий зв'язок.

1 Х-хромосома (ХУ або Х0)

2 Х-хромосоми (ХХ або ХХУ)

3 Х-хромосоми (ХХХ або ХХХУ)

4 Х-хромосоми (ХХХХ або ХХХХУ)

а) б)

Рис. 12 Зв'язок між числом Х-хромосом у каріотипі та кількістю тілець Барра в клітинах букального епітелію (а) і числом «барабанних паличок» у ядрах лейкоцитів (б)

При дослідженні Х-хроматину використовують епітеліальні клітини слизової оболонки рота (букальний епітелій), лімфоцити крові (статевий хроматин називають «барабанними паличками»), піхви, волосяного фолікула, навколоплідної рідини при пренатальній діагностиці плоду, відбитків пухлин.

Для визначення Х-статевого хроматину необхідно зробити зскрібок із слизової оболонки щоки (букальні клітини) при допомозі шпателя. Зскрібок переносять на предметне скло у вигляді мазка, наносять краплю ацетоорсеїна і накривають накривним скельцем. Оцтова кислота фіксує клітини, а орсеїн виявляє ядерні структури, не фарбуючи цитоплазми. Надлишок барвника видаляють фільтрувальним папером. Розглядають під світловим мікроскопом з імерсійним об’єктивом під великим збільшенням. Інактивована Х-хромосома має вигляд грудки у формі трикутника, півмісяця розміром 1мкм. Статевий хроматин слід рахувати тільки в клітинах з непошкодженими ядрами.

Тест Х-хроматину використовують для бліц-діагностики при хромосомних хворобах з порушенням комплексу статевих хромосом, для встановлення генетичної статі при гермафродитних станах. Крім того, його використовують для встановлення статевої приналежності тканин посмертно, і як показник гормональної чутливості злоякісних пухлин гормонозалежних органів.

Для визначення У-хроматину в епітелії букальних мазків, використовують метод люмінесцентної мікроскопії із застосуванням флюорохромних барвників. Акрихін-іприт фарбує дистальні ділянки довгих плечей У-хромосоми в метафазі та в інтерфазі. Маленькі круглі флюоресцентні тільця виявляються тільки в клітинах осіб чоловічої статі. Кількість У-хроматину відповідає кількості У-хромосом. При хромосомному комплексі ХУУ в букальних клітинах світяться два тільця, що вказує на присутність двох У-хромосом.

Застосування методу визначення статевого хроматину:

· визначення статі у випадку гермафродитизму;

· визначення статі до народження дитини (при амніоцентезі);

· діагностика спадкових хвороб, обумовлених дисбалансом статевих хромосом;

· встановлення спадкової патології дітей з порушенням інтелекту;

· виявлення спадкової патології при первинній і вторинній аменореї (відсутність менструацій у жінок);

· при неплідності чоловіків та жінок;

· у судово-медичній практиці (за дослідженнями плям крові можна встановити стать людини, якій належала ця кров.

Визначення статевого хроматину дозволяє проводити без повного каріотипування, яка потребує багато часу, експрес-діагностику числа статевих хромосом.

в) хромосомні та геномні захворювання людини

Розглянути і розв’язати наступні задачі

Задача 1.

У медико-генетичній консультації шляхом каріотипування обстежили новонародженого з дефектом скелету голови і кінцівок. Результат обстеження – наявність трьох аутосом 18-ї пари.

1. Яке захворювання у дитини?

2. Яка причина цього захворювання, якщо у батьків каріотип нормальний?

Задача 2.

До якого типу мутацій належать такі хвороби:

1. Синдром котячого крику.

2. Альбінізм.

3. Гемофілія.

4. Синдром Дауна.

5. Синдром Шерешевського-Тернера.

6. Фенілкетонурія.

7. Цукровий діабет.

8. Синдром Едвардса.

9. Філадельфійська хромосома.

10. Синдром Клайнфельтера.

Задача 3.

Який набір статевих хромосом у жінки, якщо в ядрах епітелію слизової оболонки порожнини рота виявлено грудки статевого хроматину:

1. Одну;

2. Дві;

3. Три;

4. Не виявлено.

Задача 4.

При пренатальній діагностиці статі плоду дослідили клітини амніотичної рідини. У них грудки статевого хроматину не виявлені.

1. Яка стать плоду?

2. При якій хромосомній хворобі можна одержати такий самий результат?

Задача 5.

У медико-генетичну консультацію звернулась здорова вагітна жінка з проханням визначити стать плоду, тому що її брат і перша дитина (син) страждають тяжкою формою гемофілії. У клітинах з амніотичної рідини статевий хроматин відсутній.

1. Який можна зробити висновок про стать плоду?

2. Визначте вірогідність народження хворої дитини.

Задача 6.

У медико-генетичну консультацію звернувся чоловік з приводу безпліддя. В ядрах більшості клітин епітелію слизової оболонки щоки у нього було виявлено 1 тільце Барра.

1. Про яку хромосомну хворобу може йти мова в даному випадку?

2. Як могла утворитися зигота з подібним аномальним набором хромосом?